دانشگاه اصفهان
دانشکده علوم
گروه زيست شناسي
پايان نامه ي کارشناسي ارشد رشته ي زيست شناسي گرايش ميکروبيولوژي
بررسي اتصال و تشکيل بيوفيلم باکتريايي بر روي سطوح و اثر عوامل ضد ميکروبي بر روي آن
استاد راهنما:
دکتر روحا کسري کرمانشاهي
استاد مشاور:
دکتر گيتي امتيازي
پژوهشگر:
شهريار شاکري
خرداد ماه 1384
دانشگاه اصفهان
دانشکده علوم
گروه زيست شناسي
پايان نامه ي کارشناسي ارشد رشته ي زيست شناسي گرايش ميکروبيولوژي آقاي شهريار شاکري تحت عنوان
بررسي اتصال و تشکيل بيوفيلم باکتريايي بر روي سطوح و اثر عوامل ضد ميکروبي بر روي آن
در تاريخ 2/3/1384 توسط هيات داورن زير بررسي و با درجه عالي به تصويب نهايي رسيد.
1- استاد راهنماي پايان نامه دکتر روحا کسري کرمانشاهي با مرتبه ي علمي استاد امضاء
2- استاد مشاور پايان نامه دکتر گيتي امتيازي با مرتبه ي علمي استاد امضاء
3- استاد داور داخل گروه دکتر ناصر گلبانگ با مرتبه ي علمي استاديار امضاء
4- استاد داور خارج گروه دکتر بيژن بينا با مرتبه ي علمي امضاء
امضاء مدير گروه
يا رب ز ره راست نشاني خواهم از باده آب و خـــاک جاني خواهم
از نعـمت چو?بـهرمـندم کـردي در شـکرگزاريـت زبـاني خـواهـم
با سپاس از الطاف هميشگي خداوند بزرگ
و با تشکر از استاد بزرگوارم سرکار خانم دکتر روحا کسري کرمانشاهي و استاد مشاور گرانقدرم سرکار خانم دکتر گيتي امتيازي که افتخار سه سال شاگردي در محضر ايشان را داشته ام و در لحظه لحظه اين تحقيق، راهنما و همراه من بودند.
سپاس بيکران از
يکايک افراد خانواده ام، به ويژه پدر، مادر و همسر مهربانم که بزرگوارانه مرا ياري دادند و بر کوتاهي هاي من به ديده اغماض نگريستند.
با تشکر صميمانه از:
جناب آقاي دکتر بيژن بينا داور خارج اين پايان نامه و دکتر گلبانگ داور داخل
با تشکر از:
مدير گروه محترم زيست شناسي جناب آقاي دکتر سيد جمال مشتاقيان و اساتيد محترم گروه زيست شناسي دانشگاه اصفهان، به خصوص بخش ميکروبيوليژي، جناب دکتر نحوي، دکتر بوذري، دکتر روغنيان، دکتر زرکش و مهندس امامي که در دوران تحصيل از وجود ايشان کسب فيض نمودم.
با تشکر از
کليه دوستان عزيزم به ويژه آقايان کيخسروي، شيخ بيگلو، عباسي، حسيني، قائم مقامي، حسن شاهيان، کاردي، قزلباش، حميدي، قنواتي و روماني و خانم ها الله بخشي، قرباني، نصر اصفهاني، برزگري، پورنادري، جعفري، رازبان، قلي پور، رئيسي و روحاني
تقديم به با ارزش ترين گوهر هاي زندگيم:
پدر بزرگوارم
که همچون مشعل فروزان، مظهر روشنايي زندگيم بوده
و نور وجودش براي من هميشه جاودانيت را به ارمغان آورده است.
و مادر فداکارم
که وجودش همچون ستاره اي درخشان،
روشنايي دهنده مسير زندگيم است.
و همسر مهربانم
که همچون شقايق در زندگيم،
اميد زندگي دوباره بوده و خواهد بود.
چکيده
بيوفيلم بيانگر يك جامعه است كه در آن ارتباطات دروني بين گروه‌هاي متفاوت باکتري وجود دارد. بيوفيلم مي‌تواند از يك گونه و يا گونه‌هاي مختلف ميكروبي تشكيل شود. اين ساختار نشان مي‌دهد كه ميكروارگانيسم‌ها توانايي به كار گرفتن ميان كنش‌هاي بين سلولي براي سازگاري خود با تغيير پارامترهاي محيطي را دارند. اكثر بيوفيلم‌ها داراي يك جمعيت ناهمگون از سلول‌ها، چند لايه ي احاطه شده در يك ماتريكس پلي‌ساكاريدي و كانال‌هاي آب هستند. هدف اين تحقيق بررسي ساختمان بيوفيلم ها، همچنين بررسي اتصال باکتري هاي بيوفيلم به سطوح به منظور درک خصوصيات سطحي باکتري هاي بيوفيلم و در نهايت سنجش اثر بعضي از عوامل ضد ميکروبي روي بيوفيلم به منظور حذف بيوفيلم يا کشتن سلول هاي درون آن مي باشد. در اين تحقيق ابتدا از بيوفيلم هاي موجود در سيسـتم خنـک کننده کارخانـه پلي اکريل اصفهان نمونه برداري صورت گرفت. سپس باکتري هاي g+ و g- بيوفيلم جداسازي و شناسايي شدند. در ادامـه، بـراي بـررسـي خصـوصـيات سطـحي ايـن باکتـري هـا، از روش هــاي MATH ، Co- MATH ،Bio- MATH ، اسلايد شيشه اي و ميکروپليت استفاده شد. سپس بررسي ساختمان بيوفيلم توسط ميکروسکوپ نوري و الکتروني انجام شد. در نهايت کارآيي اثر چند بيوسايد با غلظت هاي متفاوت روي بيوفيلم به منظور حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون آن از طريق روش جديد ميکروپليت مورد سنجش قرار گرفت. نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد که باکتري هاي بيوفيلم داراي خصوصيات سطحي بسيار متفاوت مي باشند. همچنين باکتري ها به طور برنامه ريزي شده بيوفيلم را تشکيل مي دهند و مي توانند ساختار هاي منحصر به فردي را بوجود آورند. در نهايت در اين تحقيق، قابليت بيوسايد هاي مورد آزمايش از نظر توانايي در حذف يا کشتن سلول هاي درون بيوفيلم، نشان داد که توانايي حذف بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و بيوفيلم مخلوط آن ها با هم، توسط بيوسايد هاي اکسيد کننده مثل هيدروژن پراکسايد و هيپوکلريت سديم در مقايسه با غير اکسيد کننده ها مثل سولفاتيازول و الکيل دي متيل آمونيوم کلرايد بسيار بالا مي باشد. در نتيجه اين بيوسايد ها براي کنترل بيوفيلم هاي پايدار روي سطح، مناسب مي باشند. همچنين مشخص شد که بيوسايد هاي غير اکسيد کننده در کنترل بيوفيلم هاي پايدار کارآيي ندارند. در حقيقت اين بيوسايد ها را بايد براي جلوگيري از رشد بيوفيلم به کار برد. يعني در حالتي که بيوفيلم هنوز رشد نکرده است کاربرد اين بيوسايد ها مناسب مي باشد. زيرا در کشتن سلول هاي باکتريايي کارآيي خوبي دارند.
فهرست مطالب
عنوانصفحه
فصل اول: مروري بر منابع 1
1- مقدمه 1
1-1- جوامع ميكروبي 1
1-2- رفتارهاي جمعي 2
1-3- ساختار و تمايز در بيوفيلم‌ها 2
1-4- فوائد اكولوژيكي؛ چرا يك بيوفيلم تشكيل مي‌شود؟ 3
1-4-1- حفاظت در برابر محيط اطراف 3
1-4-2- محافظت در برابر مواد ضد عفوني كننده 4
1-4-3- كسب مواد غذايي و همكاري‌هاي متابوليكي 4
1-4-3-1- كسب مواد غذايي 4
1-4-3-2- همكاري‌هاي متابوليكي 5
1-4-4- كسب خصوصيات ژنتيك جديد 5
1-4-5- جنبه‌هاي ژنتيكي تشكيل بيوفيلم 6
1-5-فرايندهاي اوليه در تشكيل بيوفيلم و تمايز ساختاري حاصل از آنها 7
1-5-1- تمايز ساختاري 7
1-5-2- تمايز فنوتيپي و اتصال اوليه 8
1-5-3- اتصال برگشت‌ناپذير 8
1-6- بلوغ بيوفيلم 9
1- 7-كنده شدن به عنوان يك بخش از تكامل بيوفيلم 9
1- 8- تشكيل بيوفيلم به عنوان يك فرايند تكاملي 11
1-9- ارتباطات سلول-سلول در طول تشكيل بيوفيلم 12
1- 10- خصوصيات بارز بيوفيلم 13
1-10-1- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر فيزيولوژيكي 13
1-10-2- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر رفتاري 13
1-10-3- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي با ساختار پيشرفته 13
1-11- فاكتورهاي شركت كننده در گسترش و بلوغ بيوفيلم 14
1-11-1- جنس سطح مواد 15
1-11-2- مناسب بودن سطح مورد نظر 15
1-11-3- صاف و صيقلي بودن سطح 15
1-11-4- شدت جريان آب 15
1-11-5- محدوديت مواد غذايي 16
1-12- بيوفيلم و انسان 16
1-13- بيوفيلم در سيستم‌هاي آبي 18
1-14- فرايندهاي تميزسازي 20
1-15- ميكروارگانيسم‌هاي برج‌هاي خنك كننده 21
1-15-1- جلبك‌ها 22
1-15-2- قارچ‌ها 23
1-15-3- باكتري‌ها 24
1-16- چگونگي تغذيه‌باكتري‌ها در آب 25
1-17- مشكلات ايجاد شده در سيستم‌ برج‌هاي خنك كننده‌ توسط باكتري‌ها 25
1-18- خوردگي ميكروبي 27
1-19- مسائل خوردگي 27
1-20- مسائل ايجاد رسوبات 28
1-21- باكتري‌هاي توليد كننده‌ي لايه لعابي 29
1-22- مراحل ايجاد تخريب زيستي در سيستم برج‌هاي خنك كننده 30
1-23- بيوسايدها 30
1-23-1- خصوصيات اصلي يك بيوسايد 31
1-23-2- بيوسايدهاي اكسيد كننده 31
1-23-2-1- كلرين 32
1-23-2-2- بروماين و مشتقات آن 33
1-23-2-3- اوزون 34
1-23-2-4- پراكسيد هيدروژن 34
1-23-3- بيوسايدهاي غير اكسيد كننده 34
1-23-3-1- گلوتارآلدئيد 35
1-23-3-2- تركيبات آمونيوم چهار ظرفيتي 35
1-23-3-3- ايزوتيازولون‌ها 36
1-24- مكانيسم‌هاي مقاومت باكتري‌ها در بيوفيلم به عوامل ضد ميكروبي 38
1-24-1- جلوگيري از انتشار به درون بيوفيلم 38
1-24-2- مقاومت از طريق آنزيم 38
1-24-4- حالت متابوليك ارگانيسم‌ها در بيوفيلم 39
1-24-3- واكنش خنثي‌سازي عوامل ضد ميكروبي توسط بيوفيلم 39
1-24-5- سازش ژنتيكي 40
فصل دوم: مواد و روش ها 41
2-1- مواد و وسايل 41
2-1-1- دستگاه‌ها و وسايل مورد استفاده 41
2-1-2- مواد ضد ميكروبي يا بيوسايدها 42
2-1-3- مواد مورد استفاده 42
2- 1-4- محيط‌هاي كشت 43
2-2- سويه‌هاي باكتري مورد استفاده 44
2-2-1- سويه‌هاي ايزوله شده‌ي مورد استفاده در اين تحقيق 44
2-2-2- مشخصات سويه‌ي استاندارد مورد استفاده در اين تحقيق 44
2- 3- مواد و روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري 45
2-3- 1-روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري 45
2-3-1-1- روش نمونه‌برداري از آب سيستم و لايه‌هاي بيوفيلم موجود در ديواره‌ي برج‌هاي خنك كننده 45
2-3-1- 2- نمونه‌برداري از طريق گذاشتن كوپن‌هاي فلزي در معرض جريان آب سيستم خنك كننده 47
2-4- روش‌هاي به كار رفته براي جداسازي و شناسايي باكتري‌هاي تشكيل دهنده‌ي بيوفيل روي سطح كوپن و يا باكتري‌هاي موجود در آب نمونه‌برداري شده 48
2-4- 1- روش به كار رفته براي كشت و جداسازي باكتري‌ها 48
2-4-1-1- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي كوپن 48
2-4-1-2- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي آب سيستم 48
2-4-2- شناسايي باكتري‌هاي جداسازي شده 49
2-4-2-1- روش به كار رفته براي شناسايي باكتري‌ها 49
2-4-2-2- باكتري‌ استاندارد 49
2-4-2-3- نمودار هاي شناسايي باكتري‌ها 49
2-4-2-3-1- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس باسيلوس 50
2-4-2-3-2- شناسايي مربوط به باكتري ميكروكوكوس لوتئوس 51
2-4-2-3-3- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس آسينتوباكتر و برانهاملا 52
2-4-2-3-4- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌ اکتينوباسيلوس 53
2-5- روش‌هاي به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك 54
2-5-1- روش به كار رفته براي تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك 54
2- 5-1-1- روش MATH براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌ها 54
2-6- روش‌ به كار رفته براي سنجش هم اتصالي بين سويهء Micrococcus با ساير باكتري‌هاي جدا شده از بيوفيلم 56
2-6-1- روش آزمايش co-adhesion MATH براي تعيين هم اتصالي 57
2-7- روش‌ به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي موجود در بيوفيلم 58
2-7-1- روش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم 58
2-7- 1-1- روش تست لوله‌اي براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم 58
2-7-1-2- روش انجام آزمايش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم 59
2- 8- روش‌هاي به كار رفته در ارزيابي قدرت اتصال هر يك از باكتري‌ها به سطوح و بررسي ساختار بيوفيلم 59
2-8-1- روش تشكيل بيوفيلم روي اسلايدهاي شيشه‌اي به منظور رديابي تشکيل بيوفيلم 60
2-8-1-1- روش رنگ‌آميزي اسلايدهاي شيشه‌اي 61
2-8-1-2- روش شمارش و شناسايي باكتري‌هاي متصل به سطح اسلايد 61
2-8-2- تعيين كمي تشكيل بيوفيلم و مقايسه‌ي بين قدرت باكتري‌هاي ايزوله شده براي تشكيل بيوفيلم 64
2-8-2-1- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين كميت تشكيل بيوفيلم توسط باكتري‌ها 64
2-8-3-بررسي ساختار بيوفيلم ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67
2-8-3-1- تهيه نمونه براي ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67
2-8-3-2- مکانيسم هاي تصوير سازي توسط ميکروسکوپ الکتروني 67
2-8-3-2-1- مکانيسم SE 67
2-8-3-2-2- مکانيسم BSE 68
2-9- روش‌ به كار رفته در ارزيابي قدرت حذف و يا ازبين بردن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط عوامل ضد ميكروبي 68
2-9-1- تهيه‌ي بيوسايدها با رقت‌هاي مورد نظر بر حسب ppm 69
2-9-1-1- تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي مايع 69
2-9-1-2- تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي جامد 70
2-9-1-3- روش انجام آزمايش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم توسط بيوسايدها 70
2-9-2- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط بيوسايدها 71
2-9-2-1- تهيه‌ي رنگ تري فنيل تترازوليوم كلرايد 2% 72
2-9-2-2- روش انجام آزمايش ميكروتيترپليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم و موجود در آن توسط عوامل ضد‌ميكروبي 73
فصل سوم: نتايج و مشاهدات 74
3-1- جداول شناسايي و تست هاي بيوشيمي سويه هاي ايزوله شده 75
3-1-1- باسيلوس ها 75
3-1-2- ميکروکوکوس لوتئوس 75
3-1-3- اسينتوباکتر ها 76
3- 2- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول ها 77
3-2-1- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک 77
3-2-2- نتايج مربوط به سنجش هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها 78
3-2-3- نتايج مربوط به سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم 79
3-3- نتايج حاصل از روش ميکروتيتر پليت براي تعيين کميت تشکيل بيوفيلم و مقايسه بين قدرت باکتري هاي ايزوله شده براي تشکيل بيوفيلم 80
3-4- نتايج مربوط به رديابي تشکيل بيوفيلم توسط ميکروسکوپ نوري 81
3-5- نسبت رشد سلول ها درون بيوفيلم در مدت زمان 24 ساعت 84
3-6- نتايج مربوط به مقايسه اتصال باکتري ها در بيوفيلم مخلوط به سطح اسلايد شيشه اي 84
3-7- نتايج مربوط به بررسي بيوفيلم باکتري ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 86
3-8- نتايج مربوط به تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها 91
3-8-1- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) هيپوکلريت سديم در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 91
3-8-2- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC)H2O2 در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 95
3-8-3- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) گلوتار آلدهيد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 98
3-8-4- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) سولفاتيازول در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 101
3-8-5- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) آلکيل دي متيل بنزيل آمونيوم کلرايد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 104
فصل چهارم: بحث 107
4-1- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک 107
4- 2-بررسي هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها 109
4-3- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم 110
4-5- بررسي اتصال باکتري ها به سطوح مورد آزمايش 112
4-6- بررسي و رديابي تشکيل بيوفيلم 113
4-7- بررسي رشد سلول ها درون بيوفيلم 116
4-8- بحث و بررسي در مورد تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها 117
4-9- بررسي مدل نفوذ بيوسايد به درون بيوفيلم 121
جمع بندي نهايي 123
پيشنهادات 124
فصل پنجم: منابع و مأخذ 125
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
شکل 1-1- 11
فصل دوم: مواد و روش ها
شکل 2-1- 46
شکل 2-2- 46
شکل 2-3- 50
شکل 2-4- 51
شکل 2-5- 52
شکل2-6- 53
شکل2-7- 64
فصل سوم: نتايج
شکل 3-1- 77
شکل 3-2- 78
شکل 3-3- 79
شکل 3-4- 80
شکل 3-5- 81
شکل 3-6- 82
شکل 3-7- 82
شکل 3-8- 83
شکل 3-9- 83
شکل 3-10- 84
شکل 3-11- 85
شکل 3-12- 86
شکل 3-13- 87
شکل 3-14- 88
شکل 3-15- 89
شکل 3-16- 89
شکل 3-17- 90
شکل 3-18- 92
شکل 3-19- 93
شکل 3-20- 94
شکل 3-21- 95
شکل 3-22- 96
شکل 3-23- 97
شکل 3-24- 98
شکل 3-25- 99
شکل 3-26- 100
شکل 3-27- 101
شکل 3-28- 102
شکل 3-29- 103
شکل 3-30- 104
شکل 3-31- 105
شکل 3-32- 106
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
جدول 1-1- 17
جدول 1-2- 18
جدول 1-3- 23
جدول 1-4- 24
جدول 1-5- 25
جدول 1-6- 37
فصل سوم: نتايج
جدول 3- 1- 75
جدول 3- 2- 76
جدول 3- 3- 76
جدول 3-4-80
جدول 3-5- 85
فصل اول
1- مقدمه
1-1- جوامع ميكروبي
از جنبه ها‌ي اكولوژيكي، جمعيت‌هاي باكتري هاي حاصل از يك سلول و جمعيت‌هاي مشابه از نظر متابوليكي يك مجموعه را تشكيل مي‌دهند. مجموعه‌ي اين تجمع ها (براي مثال باكتري‌هاي متانوژنيك، احياء كننده‌هاي سولفات و سولفور و تخمير كننده‌ها) فرآيندهاي فيزيولوژيكي مرتبط با هم را انجام مي‌دهند(24).
در اصل، بيوفيلم1 بيانگر يك جامعه است كه در آن ارتباطات دروني بين گروه‌هاي متفاوت وجود دارد. بيوفيلم مي‌تواند از يك گونه2 و يا گونه‌هاي مختلف ميكروبي تشكيل شود. آنها مي‌توانند بر روي سطوح متفاوتي از زنده تا غير زنده تشكيل شوند. ميكروارگانيسم‌ها همچنين مي‌توانند اجتماعات طبيعي را در فضاي مابين آب و هوا تشكيل بدهند. در حقيقت، تعريف اصلي بيوفيلم به صورت زير مي‌باشد:
اجتماعات ميكروارگانيسم‌ها و محصولات خارج سلولي در ارتباط با آنها و در فضاي مابين آنها كه به يک سطح متصل شده اند. در ابتدا Claude Zobell مشاهده كرد كه باكتري‌ها زندگي بر روي يك سطح را به حالت آزاد ترجيح مي‌دهند و سپس در سال 1987 اين فرآيند را در سيستم‌هاي آب شيرين و اكوسيستم‌هاي متنوع ديگر مورد بررسي قرار داد(64).
1-2- رفتارهاي جمعي
رفتارهاي جمعي و تمايزي پيچيده در تعدادي از ميکروارگانيسم‌ها نشان داده شده ‌است. به عنوان مثال باکتري Myxococcus در هنگام گرسنگي اجسام ميوه‌اي3 تشكيل داده وBacillus subtilis در طول تغيير شکل آن به اسپور تمايز بيوشيميايي و مورفولوژيکي نشان مي دهد. يا Streptomyces coelicolor در پاسخ به شرايط تغذيه‌اي دچار تمايز مورفولوژيک مي شود.
اين مثال‌ها نشان مي‌دهد كه ميكروارگانيسم‌ها توانايي به كار گرفتن ميان كنش‌هاي بين سلولي براي سازگاري خود با تغيير پارامترهاي محيطي را دارند. همچنين گسترش و تكامل بيوفيلم‌هاي تك گونه‌اي يا چند گونه‌اي، يك فرايند پيچيده است كه نيازمند رفتار جمعي باكتري‌ها مي‌باشد. تشكيل بيوفيلم نيز نيازمند همكاري ميان كنش‌ها و ارتباطات بين گونه‌هاي باكتري‌هاي متفاوت مي‌باشد. در حقيقت، بيوفيلم‌ها سيستم‌هاي بيولوژيكي با سطح بالايي از سازماندهي هستند(27).
1-3- ساختار و تمايز در بيوفيلم‌ها
بيوفيلم‌هاي حاصل از يك گونه و يا چند گونه، يك ساختار مشابه با يكديگر را نشان مي‌دهند. اكثر بيوفيلم‌ها داراي يك ناهمگوني4 از سلول‌ها، چند لايه ي احاطه شده در يك ماتريكس پلي‌ساكاريدي با تراكم متفاوت و داراي كانال‌هاي آب هستند. ميكروكلني‌هايي كه در ساختار بيوفيلم شركت دارند، مي‌توانند از جمعيت‌هاي يك گونه يا چند گونه از باكتري‌ها تشكيل شده باشند كه اين وابسته به پارامترهاي محيطي مي باشدكه در آن بيوفيلم تشكيل مي شود. شرايط متفاوتي مثل سطوح و خصوصيات آنها، وجود مواد غذايي، تركيب جمعيت ميكروبي و شرايط هيدروديناميكي{جريان‌هاي لامينار5 و يا توربولانت6 } مي‌توانند ساختار بيوفيلم را تحت تأثير قرار دهند.
نشان داده شده كه بيوفيلم پلي‌مورفيك مي‌باشد و از نظر ساختاري با تغيير در مواد غذايي سازگار مي‌شود. از اين رو، ساختار بيوفيلم هم تحت تأثير بيولوژي ميكروب‌ها و هم شرايط محيطي مي‌باشد(64).
كانال‌هاي آبي داراي جريان آب مي‌باشند، بنابراين، اين كانال‌ها خطوط حياتي اين سيستم را تشكيل مي‌دهند. به اين صورت كه چرخش مواد غذايي و اكسيژن و تعويض محصولات متابوليكي را با لايه‌هاي بيروني بيوفيلم امكان‌پذير مي‌سازند.
در بيوفيلم‌هاي تجزيه كننده‌ي تولوئن(چند گونه‌اي)، تولوئن در عمق بيوفيلم يافت مي‌شود كه اين مورد، انتقال آن را توسط كانال‌ها به داخل بيوفيلم نشان مي‌دهد. در اين صورت، كانال‌ها يك بخش حياتي از ساختار بيوفيلم مي‌باشند. سلول‌هاي باكتريايي در ميكروكلني‌هاي بيوفيلم توسط يك ماتريكس پلي ساکاريدي7 احاطه شده اند. شيمي اين ماتريکس پيچيده است و شامل پلي‌ساكاريد، اسيد نوكلئيك و پروتئين مي‌باشد(2).
اين پلي‌ساكاريدها در باكتري‌هاي متفاوت، فرق مي‌كنند؛ مثلاً در Pseudomonas aeruginosa پلي‌مر آلژينات، در Vibrio cholerae غني از گلوكز و گالاكتوز و در Escherichia coli از اسيد كولانيك 8 مي‌باشند. هنوز در مورد پروتئين‌ها مشخص نشده كه ايا آنها يك نقش ساختاري دارند يا از تجزيه و ليز قطعات سلول به دست آمده‌اند. پس بررسي خصوصيات مكانيكي پلي ساکاريد خارج سلولي و دستكاري آنها از طريق روش‌هاي آنزيماتيك مي‌تواند در حذف و يا پايداري بيوفيلم مؤثر باشد(17).
1-4- فوائد اكولوژيكي؛ چرا يك بيوفيلم تشكيل مي‌شود؟
1-4-1- حفاظت در برابر محيط اطراف
يكي از تركيبات اصلي درون بيوفيلم، مواد پلي‌مري خارج سلولي مي باشند كه باكتري‌ها را احاطه كرده‌اند. در حقيقت، اكثر باكتري‌ها قادرند پلي‌ساكاريد توليد كنند، كه اين مي‌تواند به صورت پلي‌ساكاريدهاي ديواره(كپسول) يا به صورت ترشحات خارج سلولي به محيط اطراف باشد. ماتريكس پلي ساکاريدي توانايي جلوگيري از دسترسي مواد ضد ميكروبي مشخص را به بيوفيلم، همانند يك سيستم تعويض يون را دارد. از اين رو، انتشار تركيبات را از فضاي اطراف به بيوفيلم مهار مي‌كند.
در حقيقت، اين عمل بستگي به خصوصيت پلي ساکاريد و تركيب مورد نظر دارد. همچنين اين پلي ساکاريد نقش محافظت سلول‌هاي باكتريايي را از استرس‌هاي محيطي متفاوت مثل اشعه‌ي UV، تغييرات pH، شوك اسمزي و خشكي را بر عهده دارد. ماتريكس پلي ساکاريدي، سلول‌ها را در مقابل اثر مخرب اشعه‌ي UV محافظت مي‌كند و از تخريب DNA جلوگيري مي‌كند(51).
1-4-2- محافظت در برابر مواد ضد عفوني كننده
بيوفيلم باكتري‌ها نسبت به سلول‌هاي پلانكتونيك9 يا باكتري‌هاي شناور10 ، در حدود 150 تا 3000 برابر مقاومت بيشتري دارد. به منظور تخريب و حذف سلول‌هاي بيوفيلم، مواد ضد عفوني كننده11 در ابتدا بايد با شبكه‌ي پلي‌ساكاريدي احاطه كننده‌ي سلول‌ها واكنش بدهند. در حقيقت، افزايش مقاومت به اين مواد مربوط به اين پلي‌ساكاريدها مي‌باشد؛ به اين صورت كه قدرت اكسيد كنندگي اين ضد عفوني كننده‌ها قبل از رسيدن به سلول‌ها توسط پلي ساکاريد خارج سلولي گرفته مي‌شود. همچنين بيوفيلم باكتريايي بعد از تيمار با بيوسايد براي محافظت از خود، پلي‌مر خارج سلولي بيشتري توليد مي‌كند(32).
1-4-3- كسب مواد غذايي و همكاري‌هاي متابوليكي
1-4-3-1- كسب مواد غذايي
كانال‌هاي آب با قابليت نفوذ بالا در تمام ساختمان بيوفيلم پراكنده هستند و ميكروكلني‌ها را احاطه كرده‌اند. اين كانال‌ها نقش انتقال مواد غذايي و متابوليت‌ها را از فضاي آبي به داخل بيوفيلم بر عهده دارند و در مقابل، متابوليت‌هاي سمي را از بيوفيلم خارج مي‌كنند(19).
مواد آلي كه به ميزان كمي در بعضي آب‌ها وجود دارند در سطح بيوفيلم توسط پلي ساکاريد خارج سلولي به دام مي‌افتند و در آن جا تجمع پيدا مي‌كنند و سپس توسط كانال‌ها به باكتري‌هاي درون بيوفيلم انتقال داده مي‌شوند(67).
1-4-3-2- همكاري‌هاي متابوليكي
خصوصيات متابوليكي باكتري‌هاي درون بيوفيلم بسيار متفاوت از همتاهاي پلانكتونيك خود مي‌باشند و ساختمان بيوفيلم فرصتي را براي همكاري‌هاي متابوليك بين باکتري هاي درون بيوفيلم فراهم مي‌كند. كلوني‌هاي موجود در بيوفيلم هر كدام يك محيط زندگي خاص خود را دارند كه از محيط هاي ديگر كلني‌ها جدا و مجزا است. اين كلني‌ها مي‌توانند محصولات فرعي توليد شده توسط كلني‌هاي ديگر(كلني‌هاي مجاور) را مورد استفاده قرار دهند. همچنين چندين گونه از باكتري‌ها كه داراي آنزيم‌هاي متفاوتي هستند مي‌توانند مواد غذايي را بشكنند و مورد استفاده قرار بدهند كه اين مورد توسط يك گونه باكتري، به تنهايي، قابل انجام نيست(24).
1-4-4- كسب خصوصيات ژنتيك جديد
انتقال افقي ژن براي تكامل و تنوع ژنتيكي جمعيت‌هاي ميكروبي مهم مي‌باشد. اهميت مطالعه‌ي انتقال ژن در محيط‌هاي طبيعي با ظهور باكتري‌هاي مقاوم به چند دارو مشخص شد. وجود پلاسميدها12 در باكتري‌ها اثبات شده و انتقال ژن توسط كونجوگاسيون13 يكي از بهترين مكانيسم‌هاي شناخته شده براي انتقال اطلاعات ژنتيكي مي‌باشد. از آن جايي كه باكتري‌ها در طبيعت بيوفيلم تشكيل مي‌دهند، كونجوگاسيون سبب انتقال ژن درون يا بين جمعيت‌هاي بيوفيلم مي‌شود. براي مثال پلاسميد Tol كه حامل يك ژن تجزيه كننده‌ي تولوئن14 و بنزيل الكل15 است. بين باكتري‌هاي يك بيوفيلم در حال رشد روي بنزيل الكل به عنوان تنها منبع كربن و انرژي گزارش شده است(89).
ساختار جمعيتي متراكم در بيوفيلم‌ها پراكندگي پلاسميدها را توسط كونجوگاسيون افزايش مي‌دهد و اين مكانيسم خود مي‌تواند تكامل بيوفيلم را سبب شود. به همين صورت به نظر مي رسد که رهاسازي DNA و ترانسفورماسيون16 بخشي از چرخه‌ي زندگي بيوفيلم باشد و در نتيجه ساختار بيوفيلم را پايدار مي‌كند. اين فرايندهاي ژنتيكي مي‌توانند سبب افزايش كارآيي فيزيولوژيكي بيوفيلم، توانايي تجزيه‌ي مواد زنوبيوتيك و يا افزايش پايداري ساختار بيوفيلم شوند(89).
1-4-5- جنبه‌هاي ژنتيكي تشكيل بيوفيلم
هم اكنون مشخص شده كه يك نوع از شيوه‌ي زندگي اكثر باكتري‌ها، به صورت متصل به سطوح يا همان بيوفيلم مي‌باشد؛ جايي كه جمعيت‌هاي باكتريايي در يك ساختار پيچيده و با تقسيم كردن مواد غذايي زندگي مي‌كنند. به اين دلايل، درك بيشتر از كيفيت سازشي باكتري‌ها در شرايط تغييرات محيطي با بررسي نحوه‌ي زندگي باكتري‌ها به صورت بيوفيلم بهتر صورت مي‌گيرد. در حقيقت، امكان دارد كه تنظيم ژن‌هاي اصلي به طور مستقيم توسط سيگنال‌هاي محيطي صورت بگيرد كه اين مي‌تواند همانند حالت كنترل احساس آستانه17 ژن‌هاي متفاوت در بيوفيلم باشد؛ جايي كه غلظت و ميزان اين سيگنال‌هاي خارجي ممكن است نسبت به سوسپانسيون طبيعي سلول‌هاي پلانكتونيك بسيار بالاتر باشد. به طور مشابه، انتقال ژن توسط كونجوگاسيون پلاسميد و ترانسفورماسيون DNA با فركانس و کارآيي بالا در بسياري از بيوفيلم‌هاي باكتريايي ديده شده است. بنابراين، پديده‌هاي مربوط به فيزيولوژي باكتري‌ها، تنظيم آن و تنظيم ژن‌ها با اثر آنها بر روي پتانسيل يك جمعيت براي تجمع و به دست آوردن خصوصيات جديد با كيفيت بالا در بيوفيلم به انجام مي‌رسند و اين سازش سبب پايداري و تثبيت شرايطي اپتيمم براي زنده ماندن باكتري‌ها مي‌شود. القاء تنظيم شده‌ي بيان ژن‌هاي خاص در بيوفيلم(شامل القاء سيگنال‌هايي كه سبب گسترش بيشتر بيوفيلم مي‌شوند) باعث به راه انداختن يك سري از وقايع مؤثر در تشكيل بيوفيلم مي‌شوند. اين نوع از القاء ممكن است به طور زيادي در ارتباط با تغيير حالت و شيوه‌ي زندگي باشد. در مقابل، پاسخ‌هاي سازشي شامل انتقال ژن، ممكن است در ارتباط با تغييرات ژنتيكي مورد نياز براي مقابله با فاژها، توكسين‌ها و آنتي‌بيوتيك هاي مفيد باشند. ترانسفورماسيون DNA و نوتركيبي بر پايه‌ي ادغام ژنومي، در ارتباط با ارگانيسم‌هاي بسيار نزديك به هم مي‌باشد؛ از آن جايي كه انتقال پلاسميد مي‌تواند بين ارگانيسم‌هايي كه رابطه‌ي خويشاوندي دوري از هم دارند صورت بگيرد. يافته‌هاي اخير نشان داده است كه فرايندهاي انتقال DNA يك اثر مثبت بر روي پايداري و گسترش بيوفيلم دارد. اين مورد پيشنهاد مي‌كند كه انتقال ژن نتيجه‌ي گسترش بيوفيلم مي‌باشد و تحت شرايط محيطي خاص انجام مي‌پذيرد(89).
5-1- فرايندهاي اوليه در تشكيل بيوفيلم و تمايز ساختاري حاصل از آنها
1-5-1- تمايز ساختاري
تشكيل بيوفيلم مي‌تواند حداقل توسط سه مكانيسم صورت بگيرد؛ يكي از اين موارد پراكندگي مجدد سلول‌هاي متصل به سطح توسط جابجايي در سطح مورد نظر مي‌باشد. نتايج حاصل از كار O’Toole و Kolter بر روي جهش يافته‌هاي Pseudomonas aeruginosa پيشنهاد مي‌كند كه حركت غلطيدن وابسته به پيلي نوع IV يك نقش را در تجمع روي سطوح براي اين ميكروارگانيسم بازي مي‌كند. مكانيسم دوم، تقسيم دوتايي سلول‌هاي متصل به سطح مي‌باشد(36). در هنگام تقسيم سلول‌ها، سلول‌هاي دختري در جهت بيرون و بالاي سطح مورد نظر قرار مي‌گيرند. در حقيقت، اين روش همانند تشكيل كلوني بر روي پليت آگار مي‌باشد. نقش هر كدام از اين مكانيسم‌ها بستگي به ارگانيسم مورد نظر، نوع سطح مورد نظر براي تشكيل كلني و شرايط فيزيكي و شيميايي محيط دارد. در Pseudomonas putida و Escherichia coli نشان داده شده است كه فعاليت سلول‌ها در مركز اجتماعات سلولي در هنگام رشد زياد آنها، كم شده است اما فعاليت آنها مي‌تواند به وسيله‌ي اضافه كردن منبع كربن مورد استفاده دوباره بازگردانده شود كه اين خود نشان مي‌دهد كه فعاليت سلول‌ها در داخل اين ساختار به وسيله‌ي وجود مواد غذايي كنترل مي‌شود. نشان داده شده است كه كانال‌هاي احاطه كننده‌ي اجتماعات سلولي مي‌توانند مقدار اكسيژن و ديگر مواد غذايي را به باكتري‌هاي درون بيوفيلم افزايش بدهند. بنابراين، ارتباط بين ساختار و عمل در اين اجتماعات سلولي وجود دارد. به نظر مي‌رسد كه ساختار بيوفيلم به طور زيادي توسط توليد ماتريكس پلي‌مري خارج سلولي تعيين مي‌شود(23).
اين ماتريکس از پلي‌ساكاريد، پروتئين و اسيد نوكلئيك تشكيل شده است. Nivens و همكاران يافتند كه سويه‌ي موكوئيدي Ps. aeruginosa يك بيوفيلم متفاوت از نظر ساختاري نسبت به سويه‌ي غير موكوئيدي توليد مي‌كند و خصوصاً آلژينات(يك تركيب اصلي از پلي ساکاريد اين سويه) در اين ساختار ديده مي‌شود. همچنين مشخص شده است كه القاء بيان ژن آلژينات در سويه‌ي غير موكوئيدي مي‌تواند سبب ايجاد يك ساختار پيچيده شود(26، 30).
1-5-2- تمايز فنوتيپي و اتصال اوليه
همانند فرايندهاي تمايزي در بسياري از سيستم‌هاي ديگر، فرايند تمايزي كه گروه كوچكي از باكتري‌هاي متصل را به يك جمعيت بيوفيلمي احاطه شده در يك ماتريكس بر روي يك سطح تبديل مي‌كند، در ابتدا به صورت يك سري از تغييرات مورفولوژيكي ديده مي‌شود. سلول‌هاي اتصال يافته‌ي تنها و تك كه تشكيل بيوفيلم را بر روي يك سطح به راه مي‌اندازند در ابتدا فقط توسط ميزان كمي از مواد پلي‌مري احاطه شده‌اند و بسياري از آنها قادر به تحرك و جابجايي هستند. در اين سلول‌هاي متصل، هنوز فرايندهاي تمايزي كه منجر به تشكيل بيوفيلم ‌شود وجود ندارد و ممكن است بسياري از آنها از سطح جدا شده و به حالت پلانكتونيك درآيند. در طول اين مرحله از اتصال برگشت‌پذير باكتري‌ها رفتارهاي خاص گونه‌اي را نشان مي‌دهند كه شامل غلطيدن18 ،خزيدن19و تشكيل توده20 مي‌باشد. اين رفتارها قبل از توليد زياد پلي‌ساكاريد خارج سلولي و اتصال غير قابل برگشت صورت مي‌گيرند(64).
همزمان با بلوغ بيوفيلم، تكامل و گسترش ميكروكلني‌ها و كانال‌هاي آبي صورت مي‌گيرد. همچنين در بسياري از سلول‌ها تغييرات فيزيولوژيكي در پاسخ به شرايط خاص محل زندگي جديد صورت مي‌گيرد. همچنين ميكروكلني‌هاي مجزا ممكن است از سطح، كنده شوند و به حالت پلانكتونيك و شناور درآيند.
1-5-3- اتصال برگشت‌ناپذير
از آن جايي كه اتصالات برگشت‌پذير روي چسبيدن باكتري به سطوح اثر مي‌گذارند، باكتري بايد در هنگام رشد به منظور تشكيل يك بيوفيلم بالغ در تماس با سطح باشد. اين تغيير از حالت اتصال برگشت‌پذير به حالت برگشت‌ناپذير در سال 1943 توسط Zobell به عنوان انتقال از حالت واكنش ضعيف سلول با ماده به يك اتصال دائم به واسطه‌ي توليد پلي‌مرهاي خارج سلولي مورد توجه قرار گرفت. البته تحقيقات اخير، تغييرات فيزيولوژيكي را مسبب اين اتصال مي‌دانند. يكي از مكانيسم‌هاي اين انتقال پيلي نوع IV مي‌باشد. همچنين توليد پلي‌ساكاريدهاي چسبنده‌ي بين سلولي نيز از موارد ديگر در Staphylococcus epidermis مي‌باشد كه تشكيل ميكروكلني‌ها را آسان مي‌كند(64).
1-6- بلوغ بيوفيلم
مرحله‌ي بعدي از تكامل بيوفيلم، بلوغ آن مي‌باشد كه حاصل گسترش ساختمان پيچيده، كانال‌ها، منافذ و پراكندگي مجدد باكتري‌ها مي‌باشد. در يك بررسي، بيوفيلم‌هاي بالغ Ps. aeruginosa نشان داده است كه بيوفيلم اين باکتري الگويProfile پروتئيني متفاوتي از سلول‌هاي پلانكتونيك دارد. نزديك به 50% از پروتئين هاي قابل شناسايي(بيشتر از 800 پروتئين) نشان داده شده است كه در بيان آنها شش برابر يا بيشتر تفاوت وجود دارد. علاوه بر اين، بيش از 300 پروتئين قابل شناسايي در بيوفيلم وجود دارد كه در سلول‌هاي پلانكتونيك قابل شناسايي نيستند، پروتئين‌هاي قابل شناسايي در 5 گروه اصلي قرار مي‌گيرند: متابوليسم، بيوسنتز LPS و فسفوليپيد، ناقلين غشايي و ترشحي.
در مطالعه‌ي ديگري با استفاده از تكنولوژي DNA microaaray براي سنجش بيوفيلم بالغ و مقايسه‌ي آن با كشت كموستات Ps. aeruginosa نشان داده شد كه فقط 70 ژن در بيوفيلم تغيير بيان داشتند. از ميان اين ژن‌ها كه بيان بالايي در بيوفيلم بالغ دارند مي‌توان به ژن‌هاي كد كننده‌ي پروتئين‌هاي شركت كننده در ترجمه، متابوليسم، انتقال غشايي يا ترشح و تنظيم ژن اشاره كرد. اين تحقيقات همچنين بيان بالاي فاكتور سيگماي rpoH و بيان پايين فاكتور سيگماي rpoS در بيوفيلم بالغ را نشان مي‌دادند(65).
1- 7-كنده شدن به عنوان يك بخش از تكامل بيوفيلم
همان طور كه گفته شد تكامل بيوفيلم مي‌تواند حداقل به چهار مرحله تقسيم‌بندي شود؛ اين مراحل عبارتند از:
1) اتصال برگشت‌پذير21
2) اتصال غير برگشت‌پذير22
3) بلوغ23
4) كنده شدن24
سلول‌هاي كنده شده به حالت پلانكتونيك در مي‌آيند. بنابراين، سيكل زندگي بيوفيلم در اين جا بسته مي‌شود. كنده شدن يك لغت عمومي براي توصيف رها شدن سلول‌ها به صورت تك و يا يك گروه از بيوفيلم يا سطح مي‌باشد. كنده شدن فعال، يك رخداد فيزيولوژيكي تنظيم شده مي‌باشد كه در اين موارد بسيار كم مطالعه شده است(76).
نشان داده شده است كه به دنبال انكوباسيون طولاني بيوفيلم‌هاي Ps. fluresence، كنده شدن صورت مي‌گيرد كه اين همراه با كاهش در پلي ساکاريد خارج سلولي بيوفيلم مي‌باشد. مرحله‌ي سكون زندگي باكتري Clostridium thermocellum همراه با افزايش كنده شدن از سطح مواد مي‌باشد.
مشخص شده كه گرسنگي ممكن است منجر به فرايند كنده شدن باكتري‌ها از طريق مكانيسمي نامعلوم شود كه سبب رها شدن باكتري‌ها براي جستجوي محيطي با مواد غذايي بيشتر مي‌شود. حدس زده مي‌شود افزايش در غلظت يك مولكول القاء كننده مسئول توليد و رهاسازي آنزيم‌هاي تجزيه كننده‌ي ماتريكس پلي‌مري مي‌باشد كه سبب كنده شدن سلول‌ها از بيوفيلم مي‌شود. مثلاً باكتري گرم مثبت Streptococcus mutans يك آنزيم آزاد كننده‌ي پروتئين سطحي25 توليد مي‌كند كه سبب رهاسازي سلول‌ها از بيوفيلم مي‌شود.
نشان داده شده است كه بيان بالاي ژن آلژينات لياز26 سبب تجزيه‌ي آلژينات مي‌شود و سبب ايجاد بيوفيلم‌هايي مي‌شود كه مي‌توانند با يك تكان شديد از سطح كنده شوند.
همچنين هنگامي كه تراكم سلول‌ها در بيوفيلم به يك حد بسيار بالا مي‌رسد، رهاسازي آنزيم‌هاي تجزيه كننده‌ي ماتريكس صورت مي‌گيرد كه اين خود منجر به كنده شدن سلول‌ها از بيوفيلم مي‌شود. شکل 1 مراحل تشکيل بيوفيلم را بصورت کلي نشان مي دهد(64).
1- 8- تشكيل بيوفيلم به عنوان يك فرايند تكاملي
همان طور كه گفته شد تشكيل بيوفيلم حداقل به 4 مرحله تقسيم مي‌شود؛ 1- اتصال برگشت‌پذير، 2- اتصال برگشت‌ناپذير، 3- بلوغ و 4- كنده شدن. سلول‌هاي كنده شده به صورت پلانكتونيك در مي‌آيند و بنابراين سيكل زندگي بيوفيلم در اين جا كامل مي‌شود. اين چهار مرحله نسبت به يكديگر تفاوت‌هاي اساسي دارند. سلول‌هاي باكتري درون هر كدام از اين مراحل از نظر فيزيولوژيكي با مراحل ديگر كاملاً متفاوت هستند. در يك مطالعه، بيوفيلم Ps. aeruginosa در هر مرحله توسط الكتروفورز ژل پلي آكريل‌‌آميد دو بعدي مورد بررسي و تجزيه و تحليل قرار گرفت و مشخص شد كه ميانگين توليد پروتئين‌هاي قابل تشخيص توسط اين روش برابر 35% مي‌باشد. انتقال از حالت پلانكتونيك به مرحله‌ي غير برگشت‌پذير نتيجه‌ي تغيير در 29% از پروتئين‌هاي سلولي مي‌باشد. به همين ترتيب، انتقال از اين مرحله به مرحله‌ي بعد سبب تغيير 40% از پروتئين‌ها مي‌باشد ولي در مرحله‌ي آخر، يك كاهش در حدود 35% در پروتئين‌هاي قابل تشخيص ديده مي‌شود. سلول‌ها در طول اين مرحله از تكامل، يك الگوي پروتئيني دارند كه بسيار شبيه به سلول‌هاي پلانكتونيك مي‌باشد. بيشترين تفاوت نيز هنگامي مشاهده شد كه سلول‌هاي پلانكتونيك با سلول‌هاي بيوفيلم بالغ مقايسه شدند.
به طور كلي مي‌توان ذكر كرد كه سلول‌ها در هر مرحله از تشكيل بيوفيلم از نظر فيزيولوژيكي تفاوت‌هاي زيادي با سلول‌ها در مراحل ديگر دارند كه اين تفاوت‌ها بيانگر همان فرايند تكاملي مي‌باشد.
1-9- ارتباطات سلول-سلول در طول تشكيل بيوفيلم
نشان داده شده است كه القا‌گر آسيل- هموسرين لاکتون در بيوفيلم‌ها قابل شناسايي است و اين پيشنهاد مي‌كند كه بيوفيلم‌ها در طبيعت داراي جمعيت‌هايي هستند كه قادرند بسته به تراكم سلول‌ها، ژن‌هاي خود را تنظيم كنند. در سال 1998، Davies و همكاران(26) نشان دادند كه Ps. aeruginosa PAO1 نيازمند محصول ژن lasI يعني هموسرين لاکتون است تا يك بيوفيلم بالغ را تشكيل دهد. آنها نشان دادند كه باكتري‌هايي داراي نقص در ژن lasI هستند، بيوفيلمي توليد مي‌كنند كه ضخامت آن فقط 20% بيوفيلم طبيعي مي‌باشد. همچنين بيوفيلم اين موتانت‌ها بر خلاف بيوفيلم طبيعي فاقد پلي‌مر و كانال‌هاي آبي مي باشد. هنگامي كه اين القاگر به محيط كشت اين باكتري‌هاي موتانت اضافه شد، همانند باكتري‌هاي وحشي تشكيل بيوفيلم بالغ دادند. اين نتايج نشان مي‌دهد كه اين القاگر عامل اصلي ساختار پيچيده‌ي بيوفيلم‌هاي بالغ مي‌باشد.
از آنجايي كه ساختار بيوفيلم وابستگي زيادي به ماتريكس پلي‌مري دارد گمان مي‌رود كه ژن‌هاي مسئول سنتز آلژينات به وسيله‌ي هموسرين لاکتون القاء مي‌شوند. اين مشاهدات نقش تحريک آستانه را به عنوان يك سيستم انتقال سيگنال براي شروع توليد آلژينات و احتمالاً ديگر انواع پلي ساکاريد خارج سلولي مشخص مي‌كند.
اين يافته‌ها نشان مي‌دهد كه كنترل تشکيل بيوفيلم توسط تحريک آستانه در Ps. aeruginosa بسيار پيچيده است و ارتباطات سلول-سلول پيچيده‌تر از آن مي‌باشد.
1- 10- خصوصيات بارز بيوفيلم
1-10-1- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر فيزيولوژيكي
با بررسي بيوفيلم‌ها مشخص مي گرددكه اين ساختارها در حقيقت بيوفيلم‌هاي چند گونه‌اي بسيار پيچيده هستند. بيوفيلم مي‌تواند هنگامي به رشد مطلوب خود برسد كه همكاري‌هاي فيزيولوژيكي براي تجزيه و مصرف مواد غذايي بين باكتري‌هاي موجود در آن به خوبي انجام شود. همانند بيوفيلم‌هايي كه در معده‌ي گاو بر روي فيبرهاي سلولزي تشكيل مي‌شوند و با همكاري‌هاي فيزيولوژيكي، اين ماده را تجزيه مي‌كنند. براي مثال در يک نوع بيوفيلم ممکن است ميكروكلني هاي متفاوتي ديده مي شود.مثلا” کلني هايي كه هيدروژن را هم توليد و هم مصرف مي‌كنند، ميكروارگانيسم هايي که با هم رابطه‌ي سينتروفي27 دارند، ميكروارگانيسم‌هاي تخمير كننده‌، و توليد کننده اسيدهاي آلي كه اين اسيد ها توسط توليد كننده‌هاي هيدروژن مورد مصرف قرار مي‌گيرند و غيره مي توانند در يک بيوفيلم ديده شوند. علاوه بر اين، پتانسيل واكنش‌هاي متابوليكي بين ميكروارگانيسم‌ها و مولكول‌هاي سيگنال ممكن است به ارتباطات بين و درون گونه‌اي كمك كند(64).
1-10-2- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر رفتاري
تشكيل اجسام ميوه‌اي توسط ميگزوباكتري‌ها تنها يك مثال از چندين بيوفيلم ماكروسكوپي است كه توسط سلول‌هاي پلانكتونيك در پاسخ به شرايط محيطي همچون گرسنگي و يا ديگر فاكتورهاصورت مي گيرد. در شرايطي كه مواد غذايي كافي وجود داشته باشد سلول‌هاي ميگزوباكتريايي از طريق حركت لغزنده‌ي28 خود به سمت مواد غذايي حركت مي‌كنند. اين الگوي پيچيده از رفتارهاي پيوسته و مرتبط توسط توليد سورفاكتانت تسهيل مي‌شود و همچنين كنترل آن توسط سيگنال‌هاي سلول-سلول مي‌باشد. هنگامي كه شرايط محيطي نامساعد مي‌شود، همانند خشكي يا كمبود مواد غذايي، ميگزوباكتري‌هاي شناور تشكيل ميكروكلني‌هايي را مي‌دهند كه در آن سلول‌هاي پلانكتونيك با هم جمع مي‌شوند و ميزان بالايي از مواد پلي‌مري خارج سلولي توليد مي‌كنند و اجسام ميوه‌اي را تشكيل مي‌دهند. سلول‌هاي باكتري درون اين بيوفيلم به كيست‌ها تمايز مي‌يابند. ساختار اين بيوفيلم نيز به ساقه و يك كلاهك تمايز پيدا مي‌كند. نتيجه‌ي اصلي اين فرايند تمايزي اين است كه سلول‌هاي يك گونه‌ي خاص يك بيوفيلم مقاوم به خشكي را تشكيل مي دهند كه در مقابل شرايط نامساعد محيطي مقاوم مي‌باشد. بنابراين، مكانيسم كنترل اين بيوفيلم‌هاي متحرك29 بر اساس سيگنال‌هاي سلولي است كه ممكن است در ارتباط با استراتژي‌هاي سلولي براي كسب مواد غذايي و مواد ديگر باشد(64).
1-10-3- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي با ساختار پيشرفته
بيوفيلم‌هاي ميكروبي به قدر كافي قطور و گسترده هستند كه بتوان آنها را با چشم غير مسلح ديد. آنها شامل ميليون‌ها موجود پروكاريوت و در بعضي موارد يوكاريوت هستند كه اين‌ها با يكديگر همكاري‌هاي متابوليكي و فيزيولوژيكي دارند. سلول‌هاي باكتريايي از يك گونه به طور دائم در يك محل خاص در بيوفيلم جاي مي‌گيرند كه اين محل مي‌تواند



قیمت: تومان


پاسخ دهید