فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصل اول: مقدمه
1-1- اهميت و ضرورت انجام تحقيق2
1-2-پرسش تحقيق5
1-3- اهداف تحقيق5
1-4- فرضيه ها6
1-5- هنر و دانش اصلاح نباتات6
1-6- چرا گياهان اصلاح مي شوند؟ 7
1-7- تنوع ژنتيکي7
1-7-1- تنوع ژنتيکي و اهميت مطالعه ي آن7
1-7-2- فرسايش ژنتيکي 8
1-7-3- حفاظت از ذخاير توارثي9
1-7-4- هتروزيس9
1-8- نشانگر مولکولي 10
1-9- انواع نشانگرهاي مولکولي 11
1-9-1- نشانگرهاي مورفولوژيکي11
1-9-2- نشانگرهاي بيوشيميايي 12
1-9-3- نشانگرهاي DNA13
1-10- انواع نشانگرهاي مولکولي جديد 15
1-10-1- RFLP15
1-10-2- RAPD16
1-10-3- AFLP16
1-10-4- SSR17
1-11- گياهشناسي عدس 19
1-12- ويژگي هاي اندام هاي رويشي و زايشي عدس 20
1-12-1- ريشه 20
1-12-2- ساقه 20
1-12-3- برگ 21
1-12-4- گل 22
1-12-5- غلاف 22
1-12-6- بذر 23
1-13- جوانه زني 23
1-14- سطح زير کشت و عملکرد گياه مورد بررسي 23
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1- نشانگرها 25
2-2- انواع نشانگر 25
2-2-1- نشانگر RAPD 25
2-2-2- نشانگر RFLP 27
2-2-3- نشانگر AFLP 28
2-2-4- نشانگر SSR 30
2-2-4- نشانگر ISSR 31
2-2-4-1- انگشت نگاري ژنومي 31
2-2-4-2- نقشه يابي ژنوم 32
2-2-4-3- برچسب زني ژن و گزينش به کمک مارکر 32
2-2-4-4- تنوع ژنتيکي و آناليز فيلوژنتيکي 33
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- تجهيزات و مواد موردنياز جهت آزمون شيميايي، ميکروبي و PCR 36
3-1-1- تجهيزات مورد استفاده 36
3-1-2- مواد مورد استفاده 37
3-1-3- بافرها و محلول ها 38
3-1-3-1- بافر TBE (TRIS-Boric acid- EDTA) 38
3-1-3-2- محلول EDTA 39
3-1-3-3- NaOH 39
3-1-3-4- CTAB BUFFER39
3-2- خصوصيات مکان آموزشي 39
3-3- طرح آزمايشي و فاکتورهاي مورد مطالعه 40
3-4- نحوه انجام آزمايش 40
3-4-1- مواد گياهي 40
3-4-2- استخراج DNA ژنومي گياه 41
3-4-2-1- استخراج DNA ژنومي به روش CTAB 41
3-4-2-2- نحوه تهيه ژل الکتروفورز 42
3-5- انجام واکنش PCR 43
3-6- مواد لازم جهت انجام PCR 43
3-6-1- آغازگر 43
3-6-2- آنزيم Taq DNA Polymerase 44
3-7- تنظيم شرايط براي PCR 44
3-8- الکتروفورز و رنگ آميزي محصول PCR 46
3-9- تجزيه و تحليل داده ها 46
فصل چهارم: نتايج و بحث
4-1- جوانه زني و سبز شدن گياهان 47
4-2- کميت و کيفيت DNA استخراجي 47
4-3- PCR نمونه ها 48
4-4- روابط فيلوژنتيک بين ژنوتيپ ها 49
فصل پنجم: نتيجه گيري
5-1- نتيجه گيري 52
5-2- بحث 53
5-3- پيشنهادات 54
منابع فارسي 55
منابع انگليسي 63
چکيده انگليسي 67

فهرست جدولها
عنوانصفحه جدول 3-1. فهرست آنزيم ها و مواد شيميايي کليدي ………………………………………………. 38 جدول 3-2. توده هاي عدس کشت شده جهت استخراج DNA ……………………………… 40 جدول 3-3. نام و توالي آغازگرهاي مورد استفاده در واکنش PCR …………………………. 43 جدول 3-4. مشخصات مخلوط واکنش PCR …………………………………………………………… 44 جدول 3-5. زمان و دماي لازم براي 4 مرحله مختلف PCR ……………………………………. 45 جدول 3-6. دماي اتصال آغازگرهاي اختصاصي …………………………………………………………. 46 جدول 4-1. آماره هاي تنوع ژنتيکي براي 10 ترکيب آغازگري بررسي شده بر روي 18 توده مختلف عدس…………………………………………………………………………. ……………….. 50

فهرست شکل ها
عنوان صفحه شکل 1-1. انواع پرايمرهاي مورد استفاده در روش ISSR ……………………………………….. 18 شکل 1-2. اندام هاي مختلف گياه عدس …………………………………………………………………… 21 شکل 3-1. برخي از وسايل مورد استفاده جهت آزمايش ها ………………………………………. 37 شکل 3-2. روند رشد گياهان در گلدان ………………………………………………………………………. 41 شکل 4-1. روند جوانه زني و سبز شدن گياهان …………………………………………………………. 47 شکل 4-2. الگوي باندي حاصل از استخراج DNA ………………………………………………….. 48 شکل 4-3. PCR انجام شده توسط پرايمر B22 ……………………………………………………… 49 شکل 4-4. دندروگرام ترسيم شده بر اساس روش UPGMA براي 18 توده عدس …51

چکيده

حبوبات دانههاي خوراکي هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند. حبوبات بعد از غلات مهمترين منبع غذايي بشر به حساب ميآيند. عدس زراعي گياهي از جنس Lens، گونه culinaris متعلق به تيره لگومينوزه، زيرخانواده پروانهآسا، از قبيله Vicieae ميباشد. عمليات اصلاحي در عدس در مقايسه با ساير محصولات مهم زراعي از قدمت کمتري برخوردار است و فعاليت نسبتا جديدي است. با توجه به اين موضوع لزوم تعيين تنوع ژنتيكي در اين گياه از اهميت ويژه اي برخوردار است و استفاده از روش هاي جديد ارزيابي تنوع ژنتيكي به منظور انتخاب والدين دو رگ و تعيين ميزان قرابت ارقام ضروري مي باشد. دراين ارتباط بهترين روش استفاده از نشانگرهاي مولكولي مي باشد، زيرا تعيين تنوع به وسيله نشانگرهاي مورفولوژيكي با توجه به اثرات متقابل محيط و ژنوتيپ و فنوتيپ گياهان، كارايي شاخص هاي مورفولوژيكي را كم مي نمايد. در اين مطالعه به منظور بررسي تنوع ژنتيكي 18 توده عدس خراسان شمالي از نشانگر مولكولي ISSR كه مبتني بر PCR است، استفاده شد. براي استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تكثير ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرايمر اختصاصي ISSR انجام پذيرفت. سپس با الكتروفورز ژل آگارز و رنگ آميزي با اتيديوم برومايد، قطعات تكثير شده مورد ارزيابي قرار گرفتند که از مجموع 125 باند توليد شده 32 باند منومورف و 93 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلي براي هر آغازگر از 5/28 درصد براي آغازگر E55تا 3/92 درصد براي آغازگر B22متغيير بود. در اين بررسي توزيع مقادير PIC بين 28/0 تا 49/0 با ميانگين 45/0 متغيير بود. شاخص نشانگر در آغازگر هاي مورد مطالعه بين 9/7 تا 2/45 قرار داشت. بيشترين مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر B22 بود که نشان دهنده قدرت تفکيک بالاتر اين آغازگر در مقايسه با ساير آغازگرها است. که با توجه به ميزان محتواي اطلاعات چند شکلي آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگرهاي B22 و RA3 و RR1 در بررسي تنوع ژنتيکي مناسب ميباشند. ميزان فاصله ژنتيکي ژنوتيپها با استفاده از روش UPGMA و در نرمافزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتيپها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزيه و تحليل مجموع الگوهاي باندي حاصل از پرايمرهاي مورد استفاده، تودهها را در سطح 5/61 درصد به 4 گروه تقسيم نمود. با توجه به اهداف اين تحقيق ميتوان به اين نتايج رسيد که بررسي تنوع ژنتيکي تودههاي عدس با استفاده از نشانگر مولکولي ISSR امکان پذير بوده و با استفاده از اين نشانگر ميتوان تودههاي مورد بررسي را به گروههاي مختلف تقسيمبندي کرد. همچنين به وسيله فاصله ژنتيکي به دست آمده بين تودهها، با توجه به درصد تشابه آنها ميتوان تودهها با فاصله ژنتيکي بيشتر را جهت استفاده در مراکز تحقيقاتي جهت توليد بذور هيبريد با هتروزيس مطلوب استفاده نمود.
کلمات کليدي: تنوع ژنتيکي، چندشکلي، عدس، نشانگر، ISSR

فصل اول : مقدمه

1-1-اهميت و ضرورت انجام تحقيق
بقولات از متنوعترين تيرههاي گياهي جدا گلبرگ بوده که بعد از تيره کاسني و ثعلب در رده نهاندانگان قرار دارند. اين تيره مشتمل بر حدود 750 جنس و 2000 گونه ميباشد (هيکي و کينگ، 1997)1. از ويژگيهاي مشترک تيره بقولات ميتوان به وجود تخمدان يک برچه و آزاد، که پس از رسيدن تشکيل ميوهاي بنام لگوم يا غلاف (نيام) را ميدهد، اشاره کرد (مجنون حسيني، 1387).
حبوبات دانههاي خوراکي هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند (اسديچالشتري و همکاران، 1385). حبوبات بعد از غلات مهمترين منبع غذايي بشر به حساب ميآيد. پروتئين حبوبات در جوامع بشري به خصوص اقشار کم درآمد نقش مهمي در تغذيه ايفا ميکند تا به آن حد که به گوشت فقرا معروف شده است (کوچکي و بنايان، 1375). گياهان خانواده لگومينوزه، در دوران کرتاسه پيدا شدهاند و به شرايط مرطوب آن زمان، که مشابه شرايط گرم و مرطوب امروزي است، سازگار شدند. بطور کلي اکثر گياهان خانواده لگومينوزه به مناطق گرم سازگار شدهاند. ولي يکي از زيرخانوادههاي آن، يعني پروانهآساها، داراي انعطاف زيادي بوده و به مناطق معتدل و سرد معتدله سازگار شدهاند (کوچکي، 1388). اين گياهان منبع مهم ويتامينهايي مانند ريبوفلاوين، ويتامين ب و کاروتن ميباشند و از لحاظ اسيدهاي آمينه ضروري مخصوصا ليزين که کمبود آن در غلات وجود دارد غني هستند (سينگ و همکاران، 1982)2. طبق مطالعات انجام شده ترکيب مناسبي از پروتئين حبوبات با غلات ميتواند سوء تغذيه و کمبود اسيدهاي آمينه را برطرف کند. در کشورهاي در حال توسعه تقريبا يک چهارم نياز پروتئيني توسط حبوبات تامين ميشود و عدس با دارا بودن

حدود 28 درصد نقش مهمي را در تغذيه مردم ايفا ميکند (پارسا و همکاران، 1384). در ميان گياهان مناطق خشک و نيمه خشک، عدس از جمله گياهاني است که غالبا در اراضي حاشيهاي و در خاکهاي نه چندان حاصلخيز کشت ميشود. اين گياه همچنين قادر است که از طريق تثبيت نيتروژن موجب بهبود حاصلخيزي خاک شود (استاوير و همکاران، 2003)3. مهمترين قاره توليد کننده عدس آسياست که 68 درصد کل توليد جهان را در اختيار دارد (توکلي، 1382). معمولا گونههاي عدس را به دو گروه اصلي تقسيم ميکنند (کوچکي و بنايان، 1375) :
1-ميکرواسپرما4 : با بذرهاي ريز گرد به قطر 2 تا 6 ميليمتر که رنگ پوسته بذر آن از زرد کمرنگ تا سياه متغير است.
2-ماکرواسپرما5 : در اين گروه بذرهاي بزرگتر و پهنتر هستند و رنگ پوسته بذر سبز کمرنگ است. اين گروه از گياهان داراي غلافها و برگچههاي بزرگتري نسبت به گروه قبلي هستند. بطور کلي گياهان ميکرواسپرما قديميتر بوده و گياهان ماکرواسپرما از ميان آنها انتخاب شدهاند.
عدس نسبت به ساير حبوبات داراي مدت پخت کوتاهتري است و راحتتر هضم ميگردد (وب و هوتين، 1376)6. عدس در رفع يبوست و اختلالات رودهاي مفيد است، همچنين در جلوگيري از سکته نيزموثر ميباشد. مرهم خمير عدس جهت التيام زخمهاي باقي مانده از آبله در طب سنتي توصيه شده است (مجنون حسيني، 1387). مقدار پروتئين عدس با باقلا برابر و از نخود بيشتر است. عدس سرشار از آهن است و همچون باقلا و نخود منبع خوبي براي تيامين و نياسين بوده، اما از نظر ويتامين B و کاروتن نسبتا فقير است (نامدار و همکاران، 1374). اگرچه عدس اساسا در تغذيه انسان استفاده ميشود ولي از آن در تغذيه حيوانات به ويژه ماکيان نيز استفاده ميگردد. کاه و ديوارههاي غلاف و بقاياي ناشي از کوبيدن آن از ارزش تغذيهاي زيادي براي دام برخوردارند (وب و هوتين، 1376).
عدس يکي از قديميترين گياهان زراعي است که منشاء آن خاکهاي حاصلخيز خاور نزديک ميباشد. قدمت اين گياه به شروع کشاورزي باز ميگردد. در مقبره فراعنه مصر آثار خميري محتوي عدس پخته بدست آمده است. نويسندگان يوناني در آثار خود به نام عدس اشاره داشتهاند و به نظر ميرسد که اين گياه به عنوان هديهاي براي خدايان مورد استفاده قرار ميگرفته است. روميان نيز ارزش زيادي براي عدس قائل بودهاند بهطوري که آن را از مصر وارد ميکردهاند (کوچکي و بنايان، 1375). نام عدس در کتابهاي مقدس ديني نظير انجيل و قرآن ذکر شده است. در قرآن (سوره بقره) عدس يکي از محصولات زميني بوده
که يهوديان از موسي(ع) خواستند که از خداوند برايشان درخواست نمايد (وب و هوتين، 1376). يکي از قديميترين آثار گياهان خوراکي بقاياي عدس است که مربوط به 7500 تا 8500 سال قبل از ميلاد مسيح ميباشد (پارسا و باقري، 1387).
به نظر ميرسد که عدس در منطقهاي بين جنوبغربي ترکيه و ترکمنستان از نژادهاي وحشي خود اهلي شده است و به سمت نيل، يونان، اروپاي مرکزي و متعاقب آن به سمت دانوب گسترش يافته باشد. بر اساس نظريههاي موجود عدس به دليل نيازهاي متفاوت اکولوژيکي موجود در گونههاي وحشي، پراکنش متفاوتي داشته و به مناطقي با شرايط مديترانهاي و همچنين در نواحي کوهپايهاي جنوبغربي آسيا سازگار شده است (کوچکي و بنايان، 1375).
اصلاح کنندگان نباتات که در جهت دستيابي به تنوع ژنتيکي موجود در کلکسيون ژرمپلاسم7 فعاليت ميکنند، نياز به داشتن اطلاعاتي در مورد ميزان تنوع دارند. عمليات اصلاحي در عدس در مقايسه با ساير محصولات مهم زراعي از قدمت کمتري برخوردار است و فعاليت نسبتا جديدي است. بهبود در عدس عمدتا بر اساس معرفي مواد انتخاب شده براي سازگاري به نواحي خاصي بوده است. در نتيجه بيشتر ارقام مورد استفاده امروزي بر اثر انتخاب در جمعيتهاي نامتجانس بدست آمده و از عمليات هيبريداسيون استفاده نشده است. پيشرفت با استفاده از اين روش محدود به تنوع موجود در اين تودهها و پيشرفتهاي اصلاحي بعدي بستگي به هيبريداسيون و انتخاب خواهد داشت. کلکسيونهايي براي حفاظت از ژرمپلاسم عدس در آمريکا، هندوستان و سوريه ايجاد شده و از اين نظر که تنوع ژنتيکي مورد نياز برنامههاي اصلاحي هيبريداسيون را فراهم ميکند ارزشمند است.
با استفاده از روشهاي انتخاب تودهاي8 والدين خالص در داخل ژرمپلاسم يا نژادهاي بومي ميتوان به سهولت و سرعت به پيشرفتهاي قابل توجهي دست يافت. اين روشها ميتوانند در کوتاه مدت نياز به واريتههاي9 اصلاح شده و همچنين مواد ژنتيکي يکنواخت مورد نياز در برنامههاي هيبريداسيون10 را فراهم کنند.
انتخاب تودهاي دو نوع گزينش را دربر ميگيرد :
1-حذف تيپهاي نامطلوب از يک مخلوط يا جمعيتهاي متنوع و برداشت گياهان باقيمانده به صورت مخلوط.
2-شناسايي تيپهاي برتر در جمعيت از طريق علامتگذاري و يا هر روش ديگر و برداشت آنها به صورت مخلوط، نتيجه نهايي اين دو روش کاهش فراواني ژنوتيپهاي نامطلوب و افزايش فراواني ژنوتيپهاي مطلوب خواهد بود.
انتخاب تودهاي ممکن است در هر نوع از منبع ژنتيکي (مثل نژادهاي بومي، جمعيتهاي هيبريد) که داراي تغييرات ژنتيکي کافي باشد و موفقيت را تضمين کند انجام شود (وب و هوتين، 1376).
از آنجا که تنوع، اساس هر برنامه اصلاحي است، به طوري که موفقيت يک برنامه اصلاحي به طبيعت و يا حجم و تنوع موجود در مواد ژنتيکي بستگي دارد. وجود حداکثر تنوع، بزرگترين شانس براي نائل شدن به موفقيت در گزينش محسوب ميشود (ميشرا و همکاران، 2007)11. با توجه به اين که ايران يکي از مراکز تنوع عدس در جهان بوده و حتي پراکندگي دو گونه وحشي آن (Lens cyanea و Lens orientalis) نيز گزارش شده است (آقايي و همکاران، 1383)، انتظار ميرود تنوع زيادي در ميان تودههاي بومي اين محصول يافت شود. تنوع ژنتيکي بين و داخل جمعيتهاي گونههاي گياهي، يکي از موارد اصلي مورد مطالعه بهنژادگران و متخصصان ژنتيک ميباشد (هايوارد و بريز، 1993)12. مور و کولينز دريافتند که توجه به ژرمپلاسم گياهان در طول نگهداري آنها، جهت پيشبيني پتانسيل ژنتيکي و استفاده از آن در برنامههاي اصلاحي ضرووري است (مور و کولينز، 1993)13. در استان خراسان شمالي عدس با سطح کشت 21312 هکتار که 20900 هکتار آن ديم ميباشد و با مقدار توليد 8363 تن بيشترين توليد و سطح کشت در بين ساير حبوبات را به خود اختصاص داده است که اين مطلب خود بيان کننده جايگاه ويژه اين محصول در استان ميباشد. با توجه به اهميت گياه عدس، انجام اقدامات اصلاحي در آن امري بسيار مهم ميباشد.

1-2-پرسش تحقيق
آيا امکان بررسي تنوع ژنتيکي تودههاي بومي عدس استان خراسان شمالي با استفاده از نشانگر مولکولي ISSR 14 وجود دارد؟
آيا در بين تودههاي مورد بررسي تنوع ژنتيکي وجود دارد؟
1-3-اهداف تحقيق
ارزيابي امکان استفاده از نشانگر مولکولي ISSR در بررسي تنوع ژنتيکي15 عدس
بررسي تنوع ژنتيکي تودههاي عدس مورد بررسي با استفاده از نشانگر مولکولي ISSR
تعيين ميزان فاصله ژنتيکي بين تودههاي مورد بررسي و استفاده از اطلاعات به دست آمده در مراکز تحقيقاتي

1-4-فرضيهها:
تنوع ژنتيکي بين تودههاي بومي عدس استان خراسان شمالي وجود دارد.
براي تشخيص تنوع ژنتيکي عدس، ميتوان از نشانگرهاي مولکولي استفاده کرد.
روش ISSR روش مناسبي براي بررسي تنوع ژنتيکي است.

1-5-هنر و دانش اصلاح نباتات
هنر اصلاح نبات به مهارت اصلاح کننده در مشاهده و تشخيص خصوصيات اقتصادي، محيطي، تغذيهاي يا ارثي وابسته است. قبل از اينکه اصلاح کنندگان، آگاهي و دانش کنوني را کسب نمايند، به طور عمده به مهارت و داوري خود در انتخاب گياهان جديدي که به طريق بذر يا رويشي تکثير ميشد تکيه داشتند. بنابراين انتخاب، قديمي ترين شکل اصلاح نبات بود (اسليپر و پولمن، 1387)16.
اگرچه، گياهان زراعي در ابتدا به واسطه نتايج جستجوي غيرهدفمند انسان (براي منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند اما امروزه اين امر بيشتر از طريق برنامه هاي اصلاحي مدبرانه حاصل مي شود. در حاليکه تغييرات در فعاليتهاي زراعي و مکانيزاسيون کشاورزي، تاثير چشمگيري بر بهرهوري زراعي داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گياهان به سبب بهبود ژنتيکي آنها بوده است. عليرغم پيشرفتهاي حاصله، بهبود بيشتر عملکرد و کيفيت محصولات، به سبب رشد جمعيت، افزايش قيمت نهادههايي چون آب، کود و انرژي و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شيميايي بر زيستبوم و تغيير سريع سلايق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد (دروسي و سالر،1983؛ بکمن و سولر، 1994)17. با پيشرفت دانش ژنتيک و ساير علوم گياهي وابسته، اصلاح نباتات به علم تبديل گرديد. اصلاح نباتات بر پايهي تشخيص ژن به عنوان واحد وراثت، روشهاي تغيير و تحول ژني و نقش رفتار ژنتيکي، که امکان برآورد دقيق نتايج حاصل از تغيير و تحول ژني را ميدهد بنيان نهاده شد. ژنها با آثارشان بر روي ظهور قابل مشاهدهي صفات گياهي نظير پاکوتاهي يا پا بلندي يا رنگ سفيد يا صورتي گل شناسايي ميشدند. از طريق دگرگردهافشاني مهار شده ترکيبات ژني ويژهاي از صفات مطلوب مختلف به داخل يک رقم گياهي ادغام ميگرديد. اخيرا دانش ژنتيک مولکولي براي پيشرفت اصلاح نبات، به سطح بالاتري از تکنيک تجربي ارائه گرديده است. ژنتيک مولکولي در توصيف ساختار شيميايي 18DNA، مادهاي که سازندهي ژن است، مشارکت دارد (اسليپر وپولمن, 1387).

1-6-چرا گياهان اصلاح ميشوند؟
هدف اصلاح نبات تغيير وراثت گياهي به روشهايي است که عملکرد گياهي را بهبود بخشد. بهبود عملکرد گياهي از راههاي بسياري مورد عمل قرار ميگيرد. معمولا اهداف اصلي بهنژادي افزايش عملکرد و کيفيت است اگرچه محصول برداشتي دانه، علوفه، الياف، ميوه، غده، گل و يا ساير اندامهاي گياهي باشد، منشا اصلي غذاي مردم جهان ميباشند. عملکرد بالاتر محصولات گياهي تاثير مهمي در تامين غذاي فراوان و سودمندتر شدن کشاورزي و کاهش هزينهي محصولات غذايي براي مصرف کننده بر عهده دارند. بهنژادي براي بهبود کيفيت در غذاهاي گياهي، موجب مغذيتر شدن محصول و افزايش سهولت در تهيه غذا يا کاهش حضور ترکيبات سمي ميگردد. افزايش سلامت گياه بر اثر بهنژادي، که منجر به مقاومت در برابر بيماري و آفت ميشود، عملکرد و کيفيت محصول را در محيطي با عمليات زراعي مطلوب افزايش ميدهد و مصرف سموم شيميايي را کاهش ميدهد (اسليپر و پولمن, 1387).

1-7-تنوع ژنتيکي
1-7-1-تنوع ژنتيکي و اهميت مطالعه آن
يکي از نيازهاي اوليهي اصلاح گونههاي گياهي، آگاهي از ميزان تنوع ذخاير توارثي و روابط ژنتيکي بين آنها ميباشد. تنوع ژنتيکي به عنوان مهمترين عامل بقاء موجودات از جمله گياهان در برابر تغييرات شرايط محيطي و آفات است (بهرا و همکاران، 2008)19. تنوع ژنتيکي اصولا از عوامل ارثي ناشي ميشود و به نسل بعد يا نتاج هم انتقال پيدا ميکند. در مقابل تنوع ژنتيکي، تنوع محيطي قرار دارد که از عوامل محيطي منشا ميگيرند. تنوع ژنتيکي ممکن است ساده باشد و به راحتي در دانه و گياه مانند رنگ گل يا دانه و وجود يا عدم وجود ريشک در غلات مشاهده شود و يا اينکه تنوع ژنتيکي ميتواند پيچيده باشد و در صفات ارثي پيچيدهاي مانند عملکرد و مقاومت به خشکي خود را بروز دهد. وجود تنوع ارثي براي بهنژادگر الزامي است و بدون آن اصلاح ژنتيکي دائمي امکان پذير نيست (اسليپر و پولمن، 1387). به طور کلي، تنوع و انتخاب دو اصل اساسي هر برنامه بهنژادي است و انجام انتخاب منوط به وجود تنوع مطلوب از حيث صفت مورد بررسي ميباشد طي هزاران سال، انتخاب طبيعي و شرايط اقليمي باعث ايجاد تنوع ژنتيکي در منابع گياهي شدهاند (سعيدي، 1382).
بنابراين تنوع ژنتيکي ابزار کار بهنژادگر است و براي بهرهگيري از آن ميتوان يا از تنوع موجود در جمعيتها استفاده نمود و يا اگر براي صفت مورد نظر تنوع وجود نداشته باشد با انتخاب والدين مناسب و تلاقي آنها، تنوع مورد نظر را براي صفت مورد نظر در برنامه اصلاحي بدست آورد (محمدي، 1381).
از عواملي که باعث ايجاد تنوع ژنتيکي ميشوند ميتوان، جهش، دورگگيري و وارد کردن ارقام را نام برد (قرنجيک، 1381). اصلاح نباتات و يا به گفته واويلوف، تکامل مصنوعي به دست بشر، همانند تکامل طبيعي، متکي به تنوع و انتخاب است (واويلوف، 1951)20. لذا تنوع ژنتيکي از نيازهاي اساسي پيشرفت در اصلاح نباتات مي باشد (رامانوجام و همکاران، 1974)21.

1-7-2-فرسايش ژنتيکي
از بين رفتن منابع ژنتيکي يا ذخاير توارثي را فرسايش ژنتيکي گويند (فارسي و باقري، 1383). امروزه ذخاير توارثي گياهي مهمترين، پرارزشترين و حياتيترين ذخاير منابع طبيعي بشر محسوب ميگردند و ارزش مادي و معنوي آنها به هيچ عنوان با ساير ذخاير و منابع طبيعي قابل مقايسه نميباشد (وجداني، 1372). در حدود سال 1950 اين نظريه قوت گرفت که منابع ژنتيکي طبيعي به سرعت در حال تخريب ميباشند و يا به اصطلاح فرسايش ژنتيکي اتفاق ميافتد. در حقيقت، فرسايش ژنتيکي در طول دهها سال بر اثر سرعت زياد در تخريب منابع ژنتيکي تداوم يافته است و اگر با همان سرعت پيش ميرفت تا سال 2000 مخازن ژرمپلاسم طبيعي همه نابود شده بودند (اسمل و همکاران، 1995)22. بنابراين گياهان با تمام ارزشهاي مادي که براي بشر دارند متاسفانه به دليل سيستمهاي دفاعي ضعيف خود تحت تاثير عوامل فرساينده منابع ژنتيکي متعددي قرار گرفته و به سرعت به زوال و نابودي کشيده ميشوند.
از مهمترين عوامل فرساينده منابع ژنتيکي ميتوان به سوانح طبيعي مانند سيل، آتشسوزي، چراي بي رويه حيوانات، بهرهبرداري بيرويه بشر از درختان جنگلي، توسعه شهرنشيني و صنعت، توسعه شبکه راههاي مختلف و امکانات حمل و نقل، توسعه کشاورزي مدرن و جايگزيني ارقام اصلاح شده به جاي ارقام بومي، اثرات سوء استفاده از نهادههاي کشاورزي مثل سم و کود و بالاخره اثرات سوء استفاده از ماشينآلات سنگين بر روي بافت خاک و پوشش گياهي اشاره نمود (وجداني، 1372).

1-7-3-حفاظت از ذخاير توارثي
ايجاد ارقام برتر از نظر زراعي که به افزايش توليد گندم کمک کردهاند، بدون استفاده از تنوع ژنتيکي امکان پذير نبوده است. آنچه مسلم است اين ميباشد که موفقيت آينده متخصصان اصلاح نباتات به حفظ ذخاير ژنتيکي امروز بستگي دارد تا بتوانند از آن در برنامههاي آتي اصلاحي خود استفاده کنند. اصلاح نباتات در صورتي شانس موفقيت در برنامههاي اصلاحي خود را دارد که امکان انتخاب مواد مناسب و تنوع وجود داشته باشد. از طرفي ديگر عوامل فرساينده ژنتيکي مختلفي باعث حذف و نابودي اين ثروت خدادادي و پرارزش شدهاند، بنابراين سرمايهگذاري براي ايجاد کلکسيونهاي گياهي و بانکهاي ژن به منظور حفظ و نگاهداري دائمي ذخاير توارثي گياهي ضروري است. هدف کلي بانکهاي ژن حفظ و نگهداري دائمي ذخاير توارثي گياهي و فراهم آوردن امکانات بهره برداري هر چه بيشتر و مفيدتر آنها و جمعآوري اطلاعات مربوط به بانکهاي ژن براي استفاده اصلاح کنندگان نباتات در جهت پيشبرد اهداف تحقيقات کشاورزي ميباشد و وظايف آنها را ميتوان به صورت زير خلاصه نمود:
مطالعات و بررسيهاي اوليه مشتمل بر تنوع ژنتيکي و پراکنش جغرافيايي گونهها
جمع آوري نمونههاي بذري و گياهي از ارقام بومي و خويشاوندان وحشي گياهان
حفاظت و نگاهداري ذخاير توارثي گياهي
احيا و ارزيابي منابع ژنتيکي گياهان جمعآوري شده
ثبت کامپيوتري اطلاعات موجود (فضلآبادي، 1384).

1-7-4-هتروزيس23
يک فرد هتروزيگوت که از تلاقي دو والد نامشابه به دست ميآيد، هيبريدي است که معمولا رشد زياد و هيکل قوي دارد. اين رشد عالي تحت عنوان هتروزيس بيان مي شود. بنابراين هتروزيس پديدهاي است که هيبريد دو والد نامشابه حداقل نسبت به ميانگين والدين، جثه و بنيه بهتري نشان مي دهد. هتروزيس پديدهاي است معمول در گونههاي دگربارور، و در بعضي از گياهان خود بارور هم گزارش شده است. کلمه هتروزيس يک کلمه يوناني است که از دو کلمه Heteros به معني اختلاف و Osis به معني حالت گرفته شده است. هتروزيس دقيقا عکس پديدهي پسروي يا انحطاط ناشي از خويشآميزي است که غالبا در گياهان دگربارور مشاهده ميشود (فارسي و باقري، 1383).
در زمان انتخاب روش اصلاحي سطح و ميزان هتروزيس موجود براي يک صفت بايستي مد نظر قرار گيرد. هتروزيس ابتدا به صورت موفقيتآميز در ذرت استفاده شد، اما اکنون در بسياري از گياهان دگربارور و خودبارور از پديده هتروزيس و توليد بذر هيبريد استفاده ميشود. در تهيه هيبريدهاي برتر هرچه دو لاين والديني از نظر ژنتيکي از هم دورتر باشند، ميزان هتروزيس در F1 بيشتر است، بنابراين ميتوان لاينهاي مورد بررسي را به گروههاي نامشابه مورد اعتمادي تقسيم کرد و در نتيجه از تعداد تلاقيهايي که بايد انجام و بررسي شوند به طور چشمگيري کاسته ميشود (نبيپور و همکاران، 1386). لزوم تعيين تنوع ژنتيکي در گياه عدس از اهميت ويژهاي برخوردار است و استفاده از روشهاي جديد ارزيابي ژنتيکي به منظور انتخاب والدين دورگ و تعيين ميزان قرابت ضروري ميباشد (غفاريپور و همکاران، 1384).
اصلاح نباتات، بعنوان فرآيند مورد استفاده در طي قرنها، به ميزان زيادي به گزينش صفات مطلوب بستگي دارد. اين گزينشها اغلب شامل چرخههاي متعدد اصلاحي به منظور انتقال خصوصيات مطلوب زراعي و کيفي از والدين متفاوت به يک ژنوتيپ24 منفرد مي باشند. پيشرفتهاي جديد در بيوتکنولوژي25 منجربه توسعه ابزارهاي بديعي که نويد بخش اصلاح نباتات سريعتر و دقيقتر ميباشند شده است. در اين ميان، مارکرهاي مولکولي26 نويد بخشترين ابزارها هستند. مارکرهاي مولکولي قطعاتي از DNA گياه هستند که اصلاحگران براي تشخيص حضور و يا عدم حضور آللهاي27 مورد علاقه در گياهان مورد آزمايش بکار ميبرند و بنابراين از آنها بعنوان ابزارهاي گزينش بهره ميبرند. گزينش گياهان مطلوب برپايه مارکرهاي متصله را در اصطلاح گزينش به کمک مارکر مينامند. با استفاده از مارکرهاي مولکولي، اصلاحگران ميتوانند روشهاي گزينش بر پايه فنوتيپ28 که شامل گياهان در حال رشد تا گياهان بالغ است را کوتاهتر ساخته و خصوصيات فيزيکي آنها را به منظور آگاهي از ساختار بنيادين ژنتيکي آنها مورد بررسي دقيق قرار دهند. (انوشيري و همکاران، 2004)29.

1-8-نشانگرهاي مولکولي
کاربرد نشانگرها در اصلاح نباتات به سالها پيش از ميلاد، زماني که بشر کار کشاورزي را شروع نمود، باز ميگردد. در اين فرايند، بشر با انتخاب گياهان با صفات مورفولوژيکي برتر براي کاشت سال بعد به صورت ناخودآگاه از نشانگرهاي فنوتيپي و مورفولوژيکي استفاده مي کردند. به اين ترتيب گزينش گياهان از همان ابتدا بر اساس نشانگرهاي مورفولوژيکي30 انجام شده است. با پيشرفت علم ژنتيک در قرن بيستم، فرايندهاي اصلاحي به صورت هدفمندتر و در سطح مولکولي نيز شکل گرفت. مطالعات بيوشيميايي و ژنتيکي بر روي گياهان و ارگانيسمها سبب شد تا انواع جديدي از نشانگرهاي ژنتيکي کشف شوند که سهم بزرگي را در اصلاح گياهان ايفا نمايند. از نظر تاريخي ميتوان گفت بهبود عملکرد گياهان با کمک روشهاي ژنتيکي بسيار بيشتر از هر عامل ديگري موثر بوده است (باقري و همکاران، 1386). به طور کلي هر صفتي که بين افراد، متفاوت باشد، ناشي از تفاوت موجود بين رديف DNAي کروموزومهاي آنها است که به نتاج نيز منتقل ميشود. حتي صفاتي که تحت تاثير شرايط محيط نيز به صورت متفاوت بروز ميکنند، بازتاب تفاوتهاي موجود در رديفهاي DNA هستند. اين تفاوتها ميتوانند به عنوان نشانه يا نشانگر به کار گرفته شوند. اين تفاوتها ممکن است به طرق مختلفي تظاهر يابند (نقوي و همکاران، 1388).

1-9-انواع نشانگرهاي مولکولي
با وجود اينکه بهرهمندي از علم ژنتيک و اصلاح نباتات بيشترين نقش را در افزايش محصول و توليد فراوردههاي غذايي به عهده داشته است، به دليل رشد روزافزون جمعيت، تلاش بيشتري براي چيرگي بر شرايط نامساعد محيطي، اعم از عوامل زيستي و غيرزيستي و افزايش کيفيت محصول لازم است. در سالهاي اخير پيشرفتهاي تحسين برانگيزي که در زمينهي زيست شناسي مولکولي و بيوتکنولوژي صورت گرفته، ابزار قدرتمندي را براي پژوهشهاي ژنتيک تفصيلي گياهان عالي از جمله گياهان زراعي فراهم کردهاند. شايد اساسيترين و مفيدترين اين ابزار نشانگرهاي DNA باشند که همان تفاوتهاي قابل ثبت رديفهاي بازي DNA موجود بين دو يا چند نمونهاند. امروزه اطلاعات به دست آمده از نشانگرهاي DNA کاربردهاي بسياري دارند، که عمدهترين آنها در پزشکي قانوني، طبقه بندي موجودات زنده و اصلاح نباتات است (نقوي و همکاران، 1388 ).

1-9-1-نشانگرهاي مورفولوژيکي
صفاتي که تحت تاثير شرايط محيط به صورت متفاوت بروز ميکنند، بازتاب تفاوتهاي موجود در رديفهاي DNA هستند. اين تفاوتها ميتوانند به عنوان نشانه يا نشانگر به کار گرفته شوند. اين تفاوتها ممکن است به طرق مختلفي تظاهر يابند. برخي از اين تفاوتها در صفات قابل رويتي مانند رنگ گل، وجود يا عدم وجود ريشک در گلچهي غلات يا صاف يا چروک بودن سطح دانه نخودفرنگي در آزمايشهاي مندل تجلي ميکنند. اين گونه نشانهها را نشانگرهاي مورفولوژيک مينامند (نقوي و همکاران، 1388). کاربرد نشانگرهاي ژنتيک به دهها سال پيش از کشف DNA به عنوان مادهي ژنتيک مربوط ميشود. صفات مورفولوژي که عمدتا توسط يک ژن کنترل ميشوند، به عنوان نشانگرهاي ژنتيک مورد استفاده قرار ميگيرند. اين نشانگرها شامل دامنه وسيعي از ژنهاي کنترل کنندهي صفات فنوتيپي هستند و جزء نخستين نشانگرها به شمار ميآيند (نقوي و همکاران، 1388). البته از صفات فنوتيپي در صورتي به عنوان يک نشانگر استفاده ميشود که در محيطهاي مختلف از تکرارپذيري بالايي برخوردار باشند (باقري و همکاران، 1386). تا چند سال اخير، نشانگرهاي مورفولوژيکي براي ايجاد نقشههاي ژنتيکي در گياهان، صفات مورفولوژيکي از قبيل پا کوتاهي، شکل برگ و غيره مورد استفاده قرار ميگرفتند. اين گونه نشانگرها داراي معايب زيادي از جمله موارد ذيل هستند:
نشانگرهاي مورفولوژيکي اثرات بزرگي بر روي فنوتيپ ايجاد ميکنند، که براي برنامههاي اصلاحي نامطلوب هستند.
نشانگرهاي مورفولوژيکي، اثرات ژنهاي کوچک اثر متصل را ميپوشانند که اين امر تشخيص لينکاژهاي31 مطلوب براي گزينش را تقريبا غير ممکن مينمايد.
نشانگرهاي مورفولوژيکي شديدا تحت تاثير محيط قرار ميگيرند. مورفولوژي يا فنوتيپ نتيجه ساختار ژنتيکي و اثر متقابل آن با محيط است (فارسي و باقري، 1383).
اين صفات فراواني و تنوع بسيار محدودي دارند، در حالي که نشانگر بايستي از تنوع بالايي برخوردار باشد.
اغلب صفات مورفولوژي در مراحل انتهايي رشد بروز ميکنند و بايد براي ظهور آنها منتظر ماند که در مورد گياهان چند ساله زمان بيشتري ميبرد (باقري و همکاران، 1386).

1-9-2-نشانگرهاي بيوشيميايي32
از آنجايي که نشانگرهاي مورفولوژيکي از معايبي برخوردارند که از ارزش آنها به عنوان يک نشانگر ژنتيکي ميکاهد لذا محققان به اين فکر افتادند که قدم را فراتر نهاده و تفاوتهاي بيوشيميايي بين افراد را در سطح مولکولهاي آلي نظير پروتئينها که ماحصل بيان ژنهاي افراد هستند، جستجو نمايند. به همين دليل توجه خود را به سمت پروتئينها و آنزيمهاي توليدي در موجودات معطوف داشتهاند (باقري و همکاران، 1386). برخي از تفاوتهاي موجود در رديف DNA بين دو موجود ممکن است به صورت پروتئينهايي با اندازههاي مختلف تجلي کنند که به روشهاي مختلف بيوشيميايي قابل ثبت، رويت و مطالعه ميگردند. اين قبيل نشانگرها را نشانگرهاي مولکولي در سطح پروتئين مينامند که از آن جمله ميتوان به آيزوزايمها اشاره کرد (نقوي و همکاران، 1388). نشانگرهاي بيوشيميايي، پروتئينهايي هستند که در اثر بيان ژن توليد ميشوند. اين پروتئينها از طريق الکتروفورز و رنگآميزي، قابل جداسازي و تشخيص ميباشند. در سالهاي اخير آيزوزايمها به طور موفقيتآميزي به عنوان نشانگرهاي بيوشيميايي در اصلاح گياهان مورد استفاده قرار گرفتهاند. آيزوزايمها فرمهاي مولکولي مختلف يک آنزيم با ماهيت پروتئيني هستند که واکنش يکساني را کاتاليز ميکنند. اين مولکولها فراوردههاي آللهاي مختلف يک يا چند مکان ژني ميباشند و از طريق واکنش رنگي مرتبط با فعاليت آنزيمي آشکار ميشوند (فارسي و باقري، 1383).

1-9-3-نشانگرهاي DNA
کاربرد نشانگرهاي آيزوزايمي33 در اواخر دهه 50 تا 70 در بررسي تنوع ژنتيکي و تاکسونومي گياهان سبب شد تا نقشههاي ژنتيکي حاوي نشانگرهاي مورفولوژيکي و آيزوزايمي براي برخي گونههاي مهم زراعي در اواخر دهه 70 بدست آيد. ولي از آنجايي که نشانگرهاي آيزوزايمي و مورفولوژيکي محدود هستند، بنابراين نقشههاي تهيه شده تا آن زمان، نقشههاي بسيار خلوتي بودهاند. لذا با توجه به اين محدوديتها گرايش به سمت بررسي چند شکلي34 در سطح DNA ايجاد شد و روشهاي مختلفي براي بررسي اين چند شکلي در سطح DNA ابداع گرديد. کشف آنزيمهاي برشي در دهه 70 و همچنين واکنش زنجيرهاي پليمراز(PCR)35 در دهه80 از جمله موفقيتهاي قابل توجهي بود که امکان بررسي تنوع و چند شکلي صفات موجودات را در سطح DNA فراهم نمود. ابداع اين نوع نشانگرها، کمک زيادي در نقشهيابي ژنتيکي36 در فواصل بسيار کم و شناسايي ژنهاي صفات کمي و کيفي نمود. بررسي تنوع ژنتيکي و روابط خويشاوندي بين و درون جمعيتها، گونهها و افراد مختلف يکي از اهداف اصلي و اوليه بسياري از تحقيقات زيستشناسي و گياهشناسي است. در سه دهه اخير از روشهاي کلاسيک نظير ريختشناسي، مورفولوژي و فيزيولوژي براي ارزيابي تنوع ژنتيکي استفاده شده است که با روشهاي مولکولي کامل ميشوند. عمده روشهاي مولکولي براي چنين ارزيابيهايي استفاده از نشانگرهاي مولکولي است. امروزه از چند شکلي DNA و پروتئين به عنوان يک نشانگر مولکولي در تحقيقات اکولوژي، ژنتيک و اصلاح گياهان استفاده ميشود.
از جمله خصوصياتي که بايد يک نشانگر مولکولي داشته باشد تا بتوان از آن براي بررسيهاي ژنتيکي استفاده نمود، عبارتند از:



قیمت: تومان


پاسخ دهید