دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده

پايان نامه (يا رساله) براي دريافت درجه کارشناسي ارشد “M.SC”
گرايش ميکروبيولوژي

عنوان
شيوع ژن هاي شيگاتوکسين و اينتيمين در سويه هاي اشريشيا کلي O157:H7 جدا شده از عفونت ادراري در شهرستان الشتر

استاد راهنما(استادان راهنما)
سرکار خانم دکتر فرزانه فيروزه

استاد مشاور(استادان مشاور)
جناب آقاي دکتر محمد زيبايي
جناب آقاي دکتر رضا نظام زاده

نگارنده
زهرا عادلي

تابستان 91
تشکر و قدرداني
سپاس خداراکه نخستين موجود است وپيش ازاوهيچ نبودوآخرين موجوداست وپس ازاو هيچ نباشد.
از اساتيد سرکار خانم دکتر فرزانه فيروزه و جناب آقاي دکتر محمد زيبايي که مرا با راهنمايي هاي ارزنده شان همراهي نمودند
همچنين از سرکار خانم پگاه شکيب کارشناس آزمايشگاه ميکروب شناسي دانشگاه علوم پزشکي لرستان که با مساعدت هاي بي دريغشان مرا در اين پروژه ياري نمودند وهمچنين پدر و مادر مهربانم سپاسگزارم .
فهرست مطالب
عنوان صفحه
مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 1
اهداف اصلي طرح ……………………………………………………………………………………………………………………………. 3
اهداف اختصاصي طرح ……………………………………………………………………………………………………………………… 3
اهداف کاربردي طرح ………………………………………………………………………………………………………………………… 3
فرضيات يا سئوالات پژوهشي ……………………………………………………………………………………………………………. 4
فصل اول بررسي متون ( کليات) ………………………………………………………………………………………………………… 5
1-1 تاريخچه History ) )…………………………………………………………………………………………………………….. 6
2-1 طبقه بندي classification)) ………………………………………………………………………………………………….. 6
3- 1زيستگاه (Habitat) …………………………………………………………………………………………………………………. 7
4- 1 شکل باکتري ……………………………………………………………………………………………………………………………. 7
5-1 كشت صفات بيوشيميابي……………………………………………………………………………………………………………… 7
6-1 مخازن و راه هاي انتقال باکتري ………………………………………………………………………………………………….. 8
7-1 ساختمان آنتي ژني ……………………………………………………………………………………………………………………. 9
8-1 عوامل ويرولانس ……………………………………………………………………………………………………………………….. 11
1_9انواع اشريشياکلي ………………………………………………………………………………………………………………………… 12
10_1 باکتري اشرشياکلي O157:H7………………………………………………………………………….. 14
ژن ها و عوامل حدت ………………………………………………………………………………………………………………………… 18
1_11زيستگاه طبيعي اشرشياکلي O157:H7………………………………………………………………… 19
1_12تشخيص …………………………………………………………………………………………………………………………………..19
13_1 اپيدميولوژي ……………………………………………………………………………………………………………………………. 20
14-1 انتقال …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 21
15-1 علائم و نشانه ها …………………………………………………………………………………………………………………….. 22
16-1 تضاهرات باليني ……………………………………………………………………………………………………………………… 22
17-1 درمان …………………………………………………………………………………………………………………………………… 24
18-1 پيشگيري ……………………………………………………………………………………………………………………………… 25
آشپزي و رژيم غذايي ……………………………………………………………………………………………………………………… 26
فصل دوم مروري بر مطالعات گذشته ……………………………………………………………………………………………. 27
فصل سوم مواد و روش‌ها ……………………………………………………………………………………………………………. 32
1-3مواد و روش كار …………………………………………………………………………………………………………………… 33
1-1-3 مواد ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 33
1-1-1-3محيط هاي كشت ………………………………………………………………………………………………………….. 33
2-1-1-3 -ساير تركيبات …………………………………………………………………………………………………………….. 33
2-1-3 -وسايل ……………………………………………………………………………………………………………………………. 34
2-3- جامعه آماري ……………………………………………………………………………………………………………………….. 34
3-3- حجم نمونه ………………………………………………………………………………………………………………………….. 34
4-3- نحوة جمع‌آوري نمونه …………………………………………………………………………………………………………… 34
5-3- كشت نمونه‌ها …………………………………………………………………………………………………………………….. 35
6-3- تشخيص آزمايشگاهي ……………………………………………………………………………………………………………. 35
1-6-3- رنگ آميزي گرم ……………………………………………………………………………………………………………….. 35
2-6-3- تست اكسيداز …………………………………………………………………………………………………………………… 35
3-6-3- تست كاتالاز ………………………………………………………………………………………………………………………35
4-6-3- تست هاي بيوشيميايي ……………………………………………………………………………………………………….. 35
1-4-6-3-آزمايش استفـاده از سيـتـرات …………………………………………………………………………………………..36
2 -4-6-3- آزمايش تحرك و توليد اندول …………………………………………………………………………………………36
3-4-6-3- آزمايش متيل رد (MR ) ……………………………………………………………………………………………….. 37
4-4-6-3- آزمايش Voges Proskauer ( VP ) …………………………………………………………………………..37
5-4-6-3-آزمايش TSI ( Triple Suger Iron Agar ) ………………………………………………………………. 37
8-3- نگهداري سويه ها ………………………………………………………………………………………………………………… 37
9-3-آماده سازي باكتري جهت استخراج DNA ……………………………………………………………………………… 38
1-9-3- تـهـيه مـحيـط كشت مايع لـوريا ( LB, Luria broth )……………………………………………………….38
2-9-3- كـشـت باكـتريها بر روي محـيط LB …………………………………………………………………………….. 38
10-3- اسـتـخـراج DNA به روش كيتBIONEER ……………………………………………………………………38
2-12-3- مـراحل استـخـراج DNA به روش كيت BIONEER ………………………………………………………39
11-3- واكنش زنجيره پليمرازي ( ( PCR ……………………………………………………………………………………….40
مـواد لازم بـراي PCR
1-13-3 – PCR با استـفاده از اين پرايـمرها انـجام شد ………………………………………………………………….41
2-13-3- آماده سازي پرايمرها ……………………………………………………………………………………………………….42
3-13-3- اجزاي واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………..42
4-13-3- نحوه انجام واكنش PCR ……………………………………………………………………………………………..43
5-13-3- آماده سازي مخـلوط اصلي ( Master mix ) براي واكـنـش PCR …………………………………..43
12-3- الكتـروفـورز ……………………………………………………………………………………………………………………..44
1-12-3- مواد مورد نياز براي ساخت ژل آگاروز …………………………………………………………………………………..45
2-12-3-تهيه بافر تانک الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………….45
3-12-3- روش تهيه ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………………..45
4-12-3 طـريـقه رنگ آميـزي ژل …………………………………………………………………………………………………… 46
13-3- عـكسبـرداري از ژل ……………………………………………………………………………………………………………47
فصل چهارم نتايج ………………………………………………………………………………………………………………………….. 48
1-4- نتايج كشت و تعيين هويت ايزوله‌هاي كلينيكي…………………………………………………………………………….49
2-4-نتايج بررسي هاي ملکولي PCR حاصل از ژن هاي 1stx ،2stx ، eaeA……………………………………….51
فصل پنجم بحث و پيشنهادات ………………………………………………………………………………………………………….54
منابع …………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 60
فهرست جداول
جدول 1-4 فراواني عوامل ايجاد کننده عفونت ادراري…………………………………………………………………………….50
جدول 2-4 فراواني ژن هاي 1stx, 2stx, eaeA…………………………………………………………………………………… 52
فهرست نمودار
نمودار 1-4 فراواني باکتري هاي ايجاد کننده عفونت ادراري در شهرستان الشتر. ……………………………………….51
فهرست اشکال
شکل1_1 ساختار باکتري اشريشيا کلي………………………………………………………………………………………………….. 6
شکل 2-1 کلني اشريشيا کلي روي محيط EMB……………………………………………………………………………………. 8
شکل 3-1 مواد غذايي که امکان وجود 7H:167O در آن زياد است…………………………………………………………… 9
شکل 4-1 انواع آنتي ژن در اشريشيا کلي. ……………………………………………………………………………………………….10
شکل 5-1 اشريشياکلي7H:167O با بزرگنمايي 6836……………………………………………………………………………….14
شکل 6_1 ساختار توکسين شبه شيگا از اشريشياکلي7H:167O. ……………………………………………………………….16
شکل 7_1آنمي هموليتيک وکاهش تعداد پلاکت در HUS. ……………………………………………………………………..16
شکل 8_1 نارسايي حاد کليه در HUS. …………………………………………………………………………………………………17
شکل 9_1عوارض ديررس بيماري HUS……………………………………………………………………………………………….18
شکل 10_1 نقشه موارد آلودگي به اشريشياکلي7H:167O……………………………………………………………………….22
شکل11_1 خلاصه سير باليني اشريشياکلي7H:167O……………………………………………………………………………….23
شکل1_4 عکس ژل پس از الکتروفورز……………………………………………………… ……………………………………52 شکل2_4 عکس ژل پس از الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………..53
چکيده :
چکيده : باکتري E.coliO157H7 يکي از عوامل اصلي ايجاد کننده مسموميت غذايي و بيماري هايي مانند : اسهال، کوليت خونريزي دهنده، سندرم اورميک همولتيک، پورپوراي ترمبو سيتوپنيک و حتي مرگ در انسان است. هدف اين پژوهش ارزيابي ژن‌هاي بيماري زاي 1stx, 2stx, eaeA در نمونه هاي ادراري شهرستان الشتر مي باشد.
روش کار: در اين پژوهش 100 نمونه عفونت ادراري از سه بيمارستان شهرستان الشتر به مدت 6 ماه جمع آوري شد و پس از کشت روي محيط هاي اختصاصي با استفاده از روش Multiplex PCR وجود ژن هاي 1stx, 2stx, eaeA مورد ارزيابي قرار گرفت.
نتايج : از 100 نمونه عفونت ادراري مورد ارزيابي، تعداد 2 جدايه با درصد فراواني(2%) داراي ژن هاي 2stx, eaeA بودند. يک جدايه (1%) داراي ژن 2stx بود و هيچ نمونه اي با هر سه ژن مشاهده نشد.
نتيجه گيري: از آنجايي که اشريشيا کلي 7H:157O يکي از نگراني هاي اساسي بهداشت و سلامت انسان محسوب مي شود . بايستي مورد توجه دائمي قرار گيرد. راه هاي پيشگيري مي تواند موجب کاهش آلودگي به اين باکتري شود.
کلمات کليدي : اشريشيا کلي 7H157O _ژن هاي شيگا توکسين _ عفونت ادراري.
مقدمه :
عفونت هاي مجاري ادراري (Urinary Tract Infections) از شايع ترين بيماري هاي عفوني در تمام دوران زندگي و از علل شايع مراجعات پزشکي مي باشد. اين عفونت ها از نظر فراواني بعد از بيماري هاي تنفسي قرار دارند و يکي از عمده ترين عفونت هاي باکتريايي در کشور هاي صنعتي و در حال توسعه محسوب مي شوند (11). UTI از جمله مشکلات حادي است که سالانه ميليون ها انسان با آن روبرو هستند و در تمام دوران زندگي در هر دو جنس مرد و زن بروز مي کند. هر ساله بين 8 تا 10 ميليون مراجعه به پزشک به علت عفونت هاي ادراري مي باشد (14). عفونت هاي مجاري ادراري علاوه بر آنکه خود به خود و به تنهايي بيماري آزار دهنده اي است گاهي سبب بروز بيماري هاي ديگري نيز خواهد شد. مثلاً برخي از عفونت هاي دستگاه ادراري مي توانند گاهي باعث از کار افتادگي کليه ها شوند و يا عفونت کليوي در خون پخش شده و سپس در تمام بدن گسترش يابند. يا برخي عفونت ها ممکن است به ايجاد سنگ کليه در بيماران منتهي شوند که همه اين ها نشان دهنده اهميت شناسايي، بررسي ميزان شيوع و درمان اين بيماري است (15). راهکارهاي مرتبط با تشخيص، درمان و پيگيري عفونت هاي ادراري روز به روز در حال تغيير هستند. لذا مي بايست رويکرد هايي کارآمد و با پيچيدگي نسبتاً کمتر براي اين ارزيابي ها توصيه شود و بسيار مهم خواهد بود که پزشکان خانواده قادر به تشخيص به موقع و درمان مناسب عفونت هاي ادراري در بيماران باشند. بيش از 90 درصد موارد عفونت هاي ادراري توسط باکتري ها ايجاد مي شود و در بقيه موارد ويروس ها، انگل ها و قارچ ها دخيل خواهند بود. شايع ترين عوامل عفونت ادراري اعضاي خانواده انتروباکترياسه علي الخصوص اشرشيا کلي و در رتبه هاي بعدي انتروباکتر، سراشيا، کلبسيلا و پروتئوس مي باشند. انواعي از کوکسي هاي گرم مثبت نيز در بروز اين نوع عفونت نقش قابل ملاحظه اي خواهند داشت (14). بررسي هاي اپيدميولوژيک نشان داده است که عفونت ادراري به سنين خاصي محدود نشده بلکه در تمام گروه هاي سني از جمله در نوزادان، کودکان و بزرگسالان مشاهده مي شود (15). اشرشيا کلي شاخص ترين عامل باکتريال عفونت هاي ادراري محسوب مي شوند. قابليت بيش از 150 سويه E.coliO157:H7 ( (E. coli جهت کلونيزاسيون در پرينه و مجاري ادراري و يا مهاجرت آن به دستگاه ادراري به دليل وجود فاکتور هاي ويرولانس خاص در اين سويه ها است. E. coli داراي 4 تيپ مهم باليني است که عبارتند از انتروتوکسيژنيک (ETEC)،انتروپاتوژنيک (EPEC)، انترو اين وي زيو (EIEC) و انتروهموراژيک (EHEC). تيپ انتروهموراژيک که به دليل ترشح نوعي توکسين، تحت عنوان اشرشيا کلي وروتوکسيژنيک (VTEC) نيز ناميده مي شود از عوامل مهم سندروم هاي خون ريزي دهنده و هموليتيک و همچنين نارسايي هاي کليوي متعاقب آن بوده که مي تواند در مجاري ادراري و دستگاه گوارشي مشکل ساز باشد. سويه O157:H7 اشرشيا کلي مهم ترين سروتيپ سويه هاي انتروهموراژيك است كه به عنوان يکي از عمده ترين سويه هاي بيماري زاي انسان معرفي شده و سالانه بروز چندين مورد مرگ و مير از طريق ايجاد عفونت هاي حاد، خصوصاً با مصرف مواد غذايي آلوده و يا تماس با منابع آلوده را سبب مي گردد. همانطور که اشاره شد، سويه هاي اشرشيا کلي انتروهموراژيک توکسيني ترشح مي کنند که به دليل توانايي آن در کشتن سلولهاي vero، وروتوکسين و به دليل شباهتش به نوروتوکسين مترشحه از شيگلا ديسانتري تيپ I، توکسين شبه شيگا (SLT) ناميده مي شود و سويه هاي توليد کننده آن به STEC نيز معروفند (13). ژن توليد کننده وروتوکسين برروي ژنوم باکتريوفاژ معتدل قرار داشته و توسط تبديل فاژي به اشرشيا کلي وارد مي گردد (13). توکسين هاي ورو به دو گروه stx1 و stx2 تقسيم بندي مي شوند. وروتوکسين با اثر بر روي RNA ريبوزومي سبب ممانعت از سنتز پروتئين ها شده و انواعي از اشرشيا کلي که اين سم را توليد مي کنند موجب بروز سندروم هاي خطرناکي از جمله کوليت هموراژيک (HC)، سندروم اورمي هموليتيک (HUS) و به دنبال آن نارسايي هاي کليوي خصوصاً در سنين پايين مي گردد (17، 18 و 19). شناسايي اين سويه ها به دليل پيچيده بودن، معمولاً به صورت روتين در آزمايشگاه ها انجام نمي پذيرد و پژوهشگران درصدد يافتن روش هاي ساده براي غربالگري اين باکتري ها هستند. از اين رو در اين مطالعه سعي مي شود تا با بررسي هاي توصيفي – مقطعي، پس از انجام روش هاي کلاسيک شناسايي و تشخيص باکتري اشرشيا کلي O157:H7، با به کار گيري روش هاي مولکولي، ضمن تأييد نتايج حاصله در تشخيص، متد هاي سريع تر و با دقت و حساسيت بالاتر نيز معرفي و ارائه گردد.
اهداف اصلي طرح
شيوع ژن هاي شيگاتوکسين و اينتيمين در سويه هاي اشريشياکلي O157:H7 جدا شده از عفونت هاي ادراري در شهرستان الشتر
اهداف اختصاصي طرح
1)تشخيص مولکولي سويه O157:H7 به روش PCR ومقايسه با تکنيک هاي کلاسيک تشخيصي
2) بررسي ژن هاي 1stx, 2stx, eaeA با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي به روش PCR
اهداف کاربردي طرح
بررسي فراواني سويه هاي O157:H7 EHEC جدا شده از عفونت هاي ادراري در شهرستان الشتر به منظور اعلام وضعيت شيوع جهت ارائه راهکار هاي درماني مناسب در کنترل و يا حذف عامل عفونت خصوصاً در رابطه با عفونت هاي احتمالي ناشي از سويه O157:H7 اشرشيا کلي
فرضيات يا سئوالات پژوهشي:
1. عفونت ادراري يكي از شايعترين عفونت ها در بيماران مراجعه كننده به مراکز پزشکي شهرستان الشتر مي باشد.
2. عفونت هاي ادراري ناشي از باکتري هاي خانواده انتروباکترياسه خصوصاً اشرشيا کلي، داراي شيوع بالاتري نسبت به عفونت هاي ايجاد شده توسط ديگر باکتري هاي مولد اين عفونت ها هستند.
3. مي توان O157:H7 اشرشيا کلي انتروهموراژيک را به عنوان يکي از عوامل باکتريايي داراي حدت بالا و همچنين مولد عفونت ادراري را از بيماران مراجعه کننده به مراکز درماني در شهرستان الشتر جدا نمود.

فصل اول
بررسي متون
(کليات)

اشريشياکلي Escherichia coli
شکل1_1: ساختارباکتري اشريشيا را نشان مي دهد.
1_1 تاريخچه History
اشريشيا کلي يک باکتري گرم منفي از خانواده انتروباکترياسه است که براي اولين بار در سال 1885 از مدفوع کودکي توسط تئودور اشريش( Theodor Escherich ) جداشد. در سال 1920 اين جنس را بنام اشريشيا ناميدند. اشريشيا کُلاي به نام هاي “اي‌ کُلاي‌” يا” کُلاي باسيل “نيز معروف است،
2-1 طبقه بندي Classification
اشريشيا کُلاي يک بيماريزاي فـرصت طلب از قـلمرو1 باکتري ، شاخه 2پروتئوباکتريا ، کلاس3 گاما پروتئو باکتريا رده4 انترو باکتريالس خانواده5 انتر باکتر ياسه، جـنس6 اشريشيا و نـوع 7 coli.E آن است.
نام علمي:
Escherichia coli (Migula 1895) Castellani and chalmers 1919
3-1 زيستگاه Habitat
در روده انسان و حيوانات زندگي مي کنند. وجود اشريشياکلي در آب و مواد غذايي دليل بر آلودگي آنها از طريق مدفوع مي باشد. اين باکتري ها از طريق دست هاي آلوده به مدفوع، گوشت خام، شير و آبميوه غير پاستوريزه منتقل مي شوند. کالباس ،سوسيس، کاهو نيز اين باکتري را منتقل ميکنند .گوشت، ماهي، شير، آب آلوده در معرض خطر آلودگي به اين باکتري هستند و مهمترين منبع اين آلودگي،سبزس هاي خام و سالاد هستند(20).
4-1 شکل باکتري Morphology
باکتري هاي طويلي هستند که دو طرف آنها موازي و دو سر آنها گرد است . گاهي بي اندازه کوتاه و زماني به شکل رشته هاي دراز ديده مي شوند. اندازه آنها 1 تا 5/1 × 2 تا 6 ميکرومتر است . يکنواخت رنگ مي شوند . گرم منفي و بدون اسپور است(22,21).
5-1 اختصاصات کشتي و بيوشيميايي
اين باکتري بيهوازي اختياري و بدون اسپور مي‌باشد. باکتري هاي اشريشيا کلاي‌، اغلب متحرک مي‌باشند. کلاي باسيل گلوکز و اکثرقندها راتخميرمي کند و گاز ايجاد مي نمايند.بر اثر تخمير لاکتوز در روي محيط هاي لاکتوزدار ، کلني آنها به رنگ قرمز در مي آيند. برخي نمونه ها لاکتوز را به کندي و يا اصلا تخمير نمي کنند. اشريشيا کلاي‌ به خوبي روي محيط هاي معمولي رشد کرده و يک باکتري کم نياز است . بعضي سويه ها بويژه آنهايي که در رابطه با عفونت هاي دستگاه ادراري هستند ، روي محيط بلاد آگار داراي بتا هموليز هستند. و بر روي محيط EMB کلني ها جلاي فلزي دارند.
شکل 2-1: کلني‌هاي اشيرشيا کلاي بر روي محيط EMB
6-1 مخازن و راه هاي انتقال باکتري
1-6-1 انتقال حيوان به انسان
گاو و گوساله مخازن اصلي اين باکتري مي باشند ولي گوسفند،خوک،آهو، بوقلمون و جوجه نيز جزو مخازن باکتري محسوب مي شوند.
2-6-1 انتقال از مواد غذايي به انسان
– گوشت گوساله اي که در طي روندهاي انجام شده بر روي آن،آلوده مي گردد. .
– سيب زميني،کلم، سيب و همچنين آب ميوه آلوده غير پاستوريزه .
– سبزيجات مانند:کاهو،اسفناج و جعفري.
– شيرهاي آلوده غير پاستوريزه.
3-6-1 انتقال انسان به انسان
بيشتر در بيمارستانها،مهدکودکها و خانه سالمندان و مدارس اتفاق مي افتد(22,21,20).
شکل3_1: سبزيجات، شير غير پاستوريزه، گوشت چرخ کرده که امکان وجود 7H:157Ocoli.E را دارند نشان ميدهد.
7-1 ساختمان آنتي ژني اشريشيا کلي
1-7-1 آنتي ژن هاي سوماتيک يا آنتي ژن O
اين آنتي ژن ها که همان اندوتوکسين باکتري هاي گرم منفي است و نسبت به حرارت پايدار بوده و از ليپوپلي ساکاريد ساخته شده است .
2-7-1 آنتي ژن کپسولي يا آنتي ژن K
آنتي ژن کپسولي که نسبت به حرارت ناپايدار بوده و از جنس پلي ساکاريد است اشريشيا کلي هايي که داراي آنتي ژن K مي باشند قدرت بيماريزايي بيشتري دارند و بعلت تداخل در امر فاگوسيتوز در برابر قواي دفاعي بدن مقاومت بيشتري نشان مي دهند
3-7-1 آنتي ژن H يا پيلي
اين آنتي ژن در اشريشياکلي هاي متحرک وجود دارد پيلي براي اتصال به رسپتورهاي موجود در سطح اندوتليوم رگي و اندوتليال لازم بوده و براي بيماريزايي نيز لازم است. اين پيلي ها به دو گروه پيلي هاي مقاوم به مانوز و حساس به مانوز تقسيم مي شوند.
پيلي هاي حساس به مانوز به رسپتورهاي داراي مانوز در سلول ميزبان متصل مي شوند پيلي هاي حساس به مانوز پيلي عمومي نيز ناميده مي شوند زيرا در بيشتر سويه هاي اشريشيا کلي وجود دارند.
پيلي هاي مقاوم به مانوز در استقرار بيماري و ايجاد بيماري مهم هستند. يکي از فاکتورهاي اتصال دهنده مقاوم به مانوز پيلي تيپ S است که کوفاکتور براي E.coli کپسول دار K1 است . پيلي مقاوم به مانوز ديگر ، پيلي P است که به رسپتورهاي خود در سطح سلول مي چسبند . اورگانيسم هاي داراي پيلي P بيشتر در ارتباط با عفونت دستگاه ادراري هستند(19,18).
شکل 4_1:انواع آنتي ژن باکتري اشريشيا کلي پيلي(آنتي ژن H) و کپسول(آنتي ژنK)،آنتي ژن سوماتيک O و آنتي ژنF نشان مي دهد.
4-7-1 انتروتوکسين ( اگزوتوکسين )
بعضي از سويه هاي اشريشيا کلي انتروتوکسين توليد مي کنند. دو نوع انتروتوکسين از اشريشيا کلي جدا شده است يکي انتروتوکسين حساس به حرارت1 (LT )و ديگري انتروتوکسين مقاوم به حرارت2 (ST ) که هر دو با هم يا به تنهايي در سويه هاي اشريشيا کلي انتروتوکسيژنيک وجود دارند.
توکسين LT از اتصال زنجيره هاي پپتيدي تشکيل شده و وزن آن تقريبا 8 کيلو دالتون است . از تجزيه اين توکسين ، دو قسمت کوچکتر بنام واحد A و B با فعاليت هاي متفاوت بدست مي آيد. واحد B مسئول اتصال سم به گانگليوزيد GM-1 سلول هاي اپيتليال روده است . اتصال واحد B به سطح پرزدار اپيتليوم روده کوچک موجب تسهيل در ورود واحدA مي گردد. واحد A از دو جزء A1 و A2 تشکيل شده است . واحد A1 باعث جداشدن آدنوزين دي فسفات ريبوز (ADP ) از آدنين دي نوکلئوتيد (ADN ) مي گردد که تنظيم کننده آدنيلات سيکلاز است. فعال شدن آدنيلات سيکلاز موجب ازدياد فراوان آدنوزين مونوفسفات حلقوي (cAMP ) مي شودکه منجر به ترشح شديد و طولاني آب و
کلرورها و عدم جذب سديم مي گردد. بعلت ازديادحجم مايعات که به درون لوله گوارشي ترشح مي گردد، حرکات
1- Thermolabile Toxin
2- Thermostable Toxin
دودي روده زياد مي شود و منجر به پيدايش اسهال مي گردد. توکسين LT آنتي ژنيک بوده و بعلت شباهت با توکسين ويبريوکلرا با آن واکنش متقاطع نشان مي دهد. توکسين ST وزن مولکولي آن تقريبا 5000 دالتون است اين توکسين ايموژنيک نيست. توکسين ST بر عکس LT و انتروتوکسين وبا فعاليت آدنيلات سيکلاز را تحريک نمي کند ، ST با تحريک گوانيلات سيکلاز توليد گوانوزين مونوفسفات حلقوي را فعال مي نمايدو بدين ترتيب باعث ازدياد ترشح مايعات به درون روده مي گردد.
5-7-1 وروتوکسين ( توکسين شبه شيگا)
اشريشياکلي حداقل دو نوع سيتوتوکسين وروتوکسين توليد مي کند که اثرات سيتوتوکسيک غير قابل برگشت روي کشت سلول هاي Vero ايجاد مي کند. اسهال ، کوليت هموراژي دهنده و سندرم اورمي هموليتيک دهنده ، به اين سيتوتوکسين ها، توکسين هاي شبه شيگايي نيز مي گويند(28,27,26).
6-7-1 ساير فاکتورها
سويه هاي EIEC (Entero invasive EC ) مشابه شيگلا بوده و در اپيتليال دستگاه روده اي نفوذ مي کند. اين ارگانيسم يک پلاسميد بزرگ دارد که آنتي ژن هاي O را کد کرده و در اتصال ارگانيسم به سلول هاي ميزبان و در نتيجه حيات درون سلول مهم مي باشد. سلول هاي اشريشيا کلي همولتيک بيشتر در عفونت هاي خارج روده اي شايع بوده و سويه هاي هموليتيک بيشتر نفروپاتوژن هستند . فاکتور ديگري که در بيماريزايي نقش دارد سيدروفور آئروباکتين است . بين توليد آئروباکتين و توليد هموليزين ارتباط وجود دارد(29).
8-1 عفونت هاي اشريشيا کلي
coli.E عامل عفونت هاي بيمارستاني مهم دستگاه ادراري مي باشد و طيف بيماري آن از سيستيس تا فيلونفريت متفاوت است خانم ها معمولا در دوران نوجواني بيشتر مبتلا شده در حاليکه آقايان در سنين بالاتر به عفونت مبتلا مي شوند. سوند در دستگاه ادراري و ديابت از فاکتورهايي هستند که در عفونت هاي دستگاه ادراري توسط coli.E موثر هستند . coli.E مي تواند سبب عفونت هاي دستگاه تنفسي شود و در بعضي جوامع coli.E عامل 20% از ذات الريه هاي بيمارستاني است . بيشتر بيماران با ذات الريه coli.E سنين بالاي 50 سال دارند . coli.E عامل مهم مننژيت نوزادان بوده و بندرت در بزرگسالان ايجاد مننژيت مي کند. ميزان مرگ و مير در اين بيمار ان بين 40% تا 80% است و افراد بهبود يافته عوارض عصبي را نشان مي دهند. coli.E ميتواند از عفونت هاي زخمي بويژه در ناحيه شکم جدا شود. پريتونيت coli.E در عمل جراحي آپانديس به فراواني يافت مي شود. coli.E مانند ساير پاتوژن هاي فرصت طلب مي تواند جريان خون را از محل هاي عفونت اوليه آلوده کند و در بيشتر بيمارستان ها عامل اصلي گند خوني گرم منفي است و مي تواند باعث شوک اندوتوکسيني شود(30).
9-1 انواع اشريشيا کلي :
برخي از سويه هاي اشريشياکلي مسئول ايجاد اسهال هستند به انواع زير دسته بندي مي شوند:
)Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)1
Escherichia coli (ETEC)Enterotoxigenic(2
(EIEC) Enteroinvasive Escherichia coli (3
E.scherichia coli (EAEC) veEnteroaggregati(4
(Escherichia coli (EHEC Entrohemorragic)5
1-9-1 اشريشيا انتروپاتوژن
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)
از مهمترين عوامل ايجاد کننده اسهال در کودکان در کشورهاي پيشرفته معرفي شده است. باکتري هاي اين گروه با چسبيدن به غشاء مخاطي انتروسيت ها سبب تخريب آنها شده در نتيجه باعث اسهال مي گردد.
2-9-1 اشريشيا انتروتوکسيژن
Escherichia coli (ETEC)Enterotoxigenic
گاستروانتريت هاي ايجاد شده در اين سويه ها توسط دو نوع توکسين حساس و مقاوم به حرارت ايجاد مي شود.اين ت.کسين متشکل از يک ساب يونيت A و پنج ساب يونيتB بوده و شبيه به توکسين کلرا مي باشد. ساب يونيت B باکتري را به همان گيرنده هاي مربوط به ويبريو کلرا مي چسباند (1GM گانگليوزيد) و باعث ورود ساب يونيتA به داخل سلول هدف مي شود. اين ساب يونيت سبب فعاليت آدنيل سيکلاز و افزايش آدنوزين منوفسفات حلقوي مي شود. در نتيجه آن سديم،کلر،پتاسيم، بيکربنات وآب از سلول ها خارج و در محوطه روده جمع شده که سبب اسهال آبکي مي گردند.توکسين مقاوم به حرارت سبب فعاليت گوانيل سيکلاز و افزايش گوانيل مونوفسفات حلقوي شده در نتيجه باعث ترشح مقدار زيادي آب و مايعات به داخل محوطه روده مي شود. ژن هاي مخصوص سنتز اين توکسين ها بر روي پلاسميد هاي قابل انتقال حمل مي شوند.اين پلاسميد ها مي توانند ژن هاي ديگري را که مخصوص فاکتور هاي چسبنده I/CFA ,II/CFA مي باشند حمل نموده و به گيرنده هاي گليکوپروتئين اتصال مي يابد. دوره کمون در اسهال هاي ناشي از اين سويه ها معمولا 1_2 روز بوده که 3_4 روز ادامه خواهد داشت.علائم بيماري نظير کلرا درد هاي شکمي، تهوع ،استفراغ و اسهال آبکي خواهد بود.
3-9-1 اشريشيا مهاجم Enteroinvasive coli Escherichia
با تهاجم و تخريب اپي تليوم مخاط روده باعث ايجاد اسهالي مي شود که با درد هاي شکمي، تب و وجود خون و گلبول هاي سفيد در مدفوع همراه است.ارگانيسم هاي اين گروه داراي پلاسميد هاي بزرگي براي چسبيدن به مخاط سلول هاي اپي تليال هستند.
4-9-1 اشريشيا انترواگريگيسيو (EAEC) veEnteroaggregati E.scherichia coli
اين سويه ها عامل اسهال هاي دراز مدت آبکي که با استفراغ و از دست رفتن آب بدن همراه است، بوده و بيشتر در کشور هاي در حال توسعه شايع مي باشد. عوامل چسبنده اي که در اين گروه از باکتري ها تشخيص داده شده نسبت به مانوز مقاوم هستند. پيلي هاي نازکي در باکتري ها وجود دارد که باعث الگوي خاص چسبندگي در آنها مي شود و وابسته به پلاسميد هستند. اين نوع هموليزين در باکتري وجود دارد که نقش بيماريزائي آن معلوم نيست. چسبيدن اين گروه از باکتري ها هيچ گ.نه تغييرات هيستولوژيکي در مخاط روده ايجاد نمي کند.
5-9-1 اشريشيا انتروهموراژيک (EHEC) agicEnterohemorrEscherichia coli
اين سويه ها که در برخي از منابع به سويه هاي اشرشيا کلي آنتروهموراژيک (EHEC) به عنوان شايع ترين عامل ايجاد کننده اسهال در کشور هاي توسعه يافته معرفي مي گردد. آلودگي با کمتر از 100 ارگانيسم سبب ايجاد بيماري مي گردد. بيماري مي تواند از فرم خفيف تا کليت خونريزي دهنده شديد که با دردهاي شکمي و اسهال خوني وکمي تب همراه است بروز کند.يکي ديگر از بيماري هاي مربوط به اين گروه سندروم اورمي هموليتيک HUS يا syndrom Uremic Hemolytic است که نشانه هاي آن نارسايي حاد کليوي ، ترومبوسيتوپني و آنمي هموليتيک بوده و در ماه هاي گرم سال و در کودکان کمتر از 5 سال شيوع بيشتري دارد. بيشترين موارد اپيدمي و آندمي بيماري در اثر مصرف شير پاسنوريزه نشده و گوشت هاي گاو که بطور کامل پخته نشده اند و عصاره ميوه جات آلوده به فضولات حيواني ديده مي شود. سويه هاي 7H:157O ,157O غير متحرک توليد شيگا توکسين مي نمايند .حداقل دو تايپ مجزا از توکسين (1srx ,2stx) مشاهده شده است علاوه بر اين چهار واريته متفاوت از 2stx گزارش شده است (28).
10_1 باکتري اشريشيا کلي O157:H7 :
شکل5_1:تحت بزرگنمايي 6836x، تعدادي از باکتري هاي گرم منفي اشرشياکلي سويه O157:H7را به تصوير کشيده است.
اين باکتري يک گونه از باکتري هاي اشريشيا کلي Enterohemorragic است و باعث ايجاد بيماري از طريق مواد غذايي مي باشد (22). اين عفونت اغلب منجر به اسهال هموراژيک و گاهي اوقات به نارسايي کليه بخصوص در کودکان کم سن‌وسال و افراد مسن مي‌شود(34,33).
بسياري از بيماران با خوردن گوشت گاو پخته نشده آلوده يا گوشت خوک آلوده، همچنين، شنا کردن در آب آلوده، آشاميدن آب آلوده، خوردن سبزيجات آلوده بيمار مي‌شوند(38,37,36,35).
اين باکتري گرم منفي و ميله‌اي شکل هستند که”O” در اين نام به تعداد آنتي‌ژن ديواره سلولي (سوماتيک) اشاره دارد. در حالي که “H” اشاره به آنتي‌ژن تاژک است. “O”,”H” مخفف Hauch ,Ohne مي باشند (22,21). اشريشياکلي7H157O يکي از 100 نوع سويه اشريشيا کلي است که بيماري زايي دارد در حالي که بسياري از گونه ها بي ضرر هستند و به طور معمول در روده پستانداران يافت مي‌شوند اين باکتري با توليد سم شيگا توکسين باعث ايجاد بيماري شديد مي‌شود. اشريشيا کلي انتروهموراژيک يک غضو از کلاس اشرشيا کلي هاي پاتوژن مي‌باشد که اغلب قادر به توليد Verocytotoxin (VTEC) يا توليد شيگا توکسين مانند(SREC) مي‌کنند (22,21). مهمترين فاکتور ويرولانت اشريشيا کلي 7H157O، توليد يک يا چند شيگا توکسين است که به نام وروکوتوکسين ناميده مي شود (قبلا به نام توکسين هاي شبيه شيگا ناميده مي شوند). اولين آنها شيگا توکسينI است که قابل شناسايي از شيگا توکسين توليد شده توسط شيگا ديسانتري تيپI نمي باشد، توکسين دوم شيگا، ملکول متفاوتي بوده و فقط 56% از اسيدهاي آمينه با شيگا توکسينI همولوگ است.اغلب سوش هاي E.coli O157:H7 ،قادر به توليد شيگا توکسينII هستند و درصد توليد شيگا توکسينI از25 درصد در سوش هاي اروپايي تا بيشتر از 80% در آمريکاي جنوبي و ژاپن متغيير مي باشد (39).
هر دو توکسين 5 ساب يونيتB ويک ساب يونيت A دارد. که روي کورموزوم E.coli O157:H7 قرار مي گيرد.ساب يونيت B به 3Gbکه يک گليکوليپيد با فعاليت نامعلوم و به تعداد متغيير در مامبران سلول هاي يوکاريوت3 است باند مي شود.بعد از آندوسيتوز، ساب يونيت A،ساب يونيت ريبوزومال S60 را از نظر آنزيماتيک غير فعال نموده و بنابراين سنتز پروتئين سلولي را مسود مي کند. مکانيسم ايجاد کوليت هموراژيک و سندرم هموليتيک اورميک مشخص نيست.ارگانيسم به سلول هاي مخاطي روده بزرگ مي چسبندو آسيب ايجاد مي کنند. بديهي است که اين مکانيسم براي توليد اسهال غير آبکي کافي است ولي توکسين شيگا اثرات موضعي هيستوپاتولوژيک، شامل خونريزي و ادم در لاميناپروبر يا نکروز موضعي سطحي مي باشد (39).
شکل6_1:توکسين شبه شيگا از E.coli O157:H7.
سندرم همولتيک اورميک بعد از اسهال، يک بيماري ميکرواسکولر است. که وقتي توکسين هاي شيگا در روده توليد شد، وارد خون شده و به سلول هاي اندوتليال کليه که واحد گيرنده ي 3Gbهستند متصل مي شوند. آسيب سلول هاي اندوتليال ناشي از توکسين هاي شيگا مي توانند شروع کننده تجمع پلاکت و فيبرين، آسيب رساندن به عبور گلبول قرمز (هموليز) و انسداد ميکرواسکولرهاي کليه(نارسايي کليه) باشد. شايان ذکر است که ترمبوسيتوپني به علت بدام افتادن پلاکت ها در ارگان هاي درگير و حذف آنها به وسيله کبد و طحال ايجاد مي شود. سيتو توکسين ها و ليپوپلي ساکاريد باکتريال در جريان خون نقش مهمي در تشديد ين روند،ايفا مي کنند، اگر چه کليه ها اغلب درگير است ارگان هاي ديگر از حمله مغز ممکن است درگير شده و عوارض وسيعي به بار آورند (40,39).
شکل7_1:آنمي هموليتيک و در نهايت کاهش تعداد پلاکت ها در اثر سندرم هموليتيک اورميک.
1_10_1اين سندرم شامل موارد و گرفتاري‌هاي زير مي‌باشد:
1. آنمي هوليتيک (بيماري‌اي که در آن در اثر ليز شدن يا حل شدن گويچه‌هاي سرخ فرد دچار کم‌خوني مي‌شود.
2. نارسايي حاد کليه.
3. کاهش تعداد پلاکت‌ها.
شکل8_1:نارساي حاد کليه به علت سندرم هموليتيک اورميک.
2-10-1 عوامل زير در بيماران مبتلا به عفونت E.coli O157:H7 ريسک پيدايش سندرم هموليتيک اورميک را افزايش مي دهند(39):
1-استفاده از دارو هايي که حرکات روده را کند مي کند.
2-اسهال خوني.
3-تب.
4-استفراغ
5-افزايش لکوسيت خوني
6-دو انتهاي سن (بخصوص بچه هاي کمتر از 5 سال)
7-جنس مونث
3 تا 5 درصد بيماران مبتلا به اين سندرم بطور ناگهاني فوت مي کنند و همين حدود هم به طرف بيماري مزمن کليوي مي روند، در ضمن بعضي از بيماراني که فعاليت کليه آنها به حالت عادي برمي گردد ممکن است پروتئينوري مزمن و بعضي نارسايي کليه ماه ها يا سال ها بعد حادث شود. عوارض ديررس بصورت سنگ کليه صفرا، تنگي کولون، پانکراتيت مزمن، عدم تحمل گلوکز و اختلالات رفتاري گزارش شده است. که در شکل زير خلاصه گرديده است(41).
سندرم هموليتيک اورميک
60%بهبودي 30%پروتئينوري
5%نارسايي مزمن کليه 3تا5%مرگ و مير
شکل9_1:عوارض ديررس بيماري HUS
اين باکتري در سال 1982 به عنوان يک عامل بيماري‌زا درنتيجه، شيوع يک بيماري غير معمول گوارشي (معده و روده)به رسميت شناخته شد.که شيوع اين بيماري بر اثر خوردن همبرگر آلوده ايجاد شده که همانند چنين حوادثي در ايالات متحده وژاپن گزارش شده است (39).اين باکتري سوربيتول منفي است در حالي که 93% تمام اشريشيا کلي ها سوربيتول را تخمير مي‌کنند(40).همچنين اين باکتري فاقد توانايي فعاليت بتاگلوکرونيدازي (MUG) مي‌باشد (41).و همچنين عدم توانايي رشد در دماي 45 درجه سانتيگراد و در حضور نمک هاي صفراوي 15/0% را دارا مي‌باشد (42,41). سروتيپ هاي 7H157O پيدايش‌شان از يک جد مشترک بوده است، که اين امر باعث مي شود ارتباط بسيار نزديکي از لحاظ ژنتيکي داشته باشند، به عنوان مثال اشريشيا کلي 7h55O با 7H157O نزديکترين ارتباط را با انشعاب از يک جد مشترک پاتوژن دارند که توانايي اتصال Effacing را به آنها داده است(46).
ژن ها و عوامل حدت:
از جمله عوامل حدت سموم کاتالاز پري پلاسميک و شيگا توکسين مي‌باشند. اين سموم باعث غير فعال کردن زير‌واحد RNA ريبوزمي S60 در سلول هاي يوکاريوتي ميشود، و باعث مسدود کردن ترجمه mRNA و در نتيجه مرگ سلول مي شود (47).سموم شيگا توکسين عملکرد يکساني با سموم توليد شده توسط شيگلا مهاجم دارند(48). اين گونه از اشريشيا کلي توانايي توليد شيگا توکسين را از طريق آلودگي به فاز بيان مي کند (50,49). کاتالاز پري پلاسميک روي پلاسميد 157Po کد مي شود، و از جمله عوامل حدت محسوب مي شود که با فراهم آوردن اکسيداتيو اضافي در ميزبان هنگام آلودگي مي شود (51). يکي ديگر از عوامل بيماري‌زاي اين سويه پوتئيني به نام اينتمين (intimin) است که يک پروتئيني 94 کيلو دالتوني در غشاء خارجي ميباشد و به وسيله ژن eaeA کد مي شود.اين پروتئين مسئول اتصال نزديک باکتري به سلول هاي اپي تليال روده و ايجاد آسيب هاي خارجي به نام اتصال و محو شدن (affacing/Attaching) بوده (28). و باعث ايجاد ساختار فنجاني شکل (cap like) در سلول اپي تليال روده مي باشد. به همين دليل به ژن کد کننده اين پروتئين
( affacing and attaching coli.E) eae مي گويند.
همچنين انتروهموليزين که به وسيله ژن hly کد مي شود نيز از عوامل موثر بيماري زايي اين سويه محسوب مي شود (54,53,52)
11_1 زيستگاه طبيعي E.coli O157:H7:
با اينکه وجود E.coli O157:H7 نسبتا غير معمول است. ولي به طور طبيعي مي‌تواند در محتويات روده‌اي برخي از گاوها يافت شود (55). و از آنجايي که نشخوار کنندگان فاقدگيرنده براي سمي که اي باکتري توليد مي کند، هستند پس در آنها بيماري ايجاد نمي‌کند و کامنسال در نظر گرفته شده است.
12_1 تشخيص: Diagnosis
تشخيص اين باکتري از طريق کشت مدفوع امکان پذير نيست. بنابراين براي تشخيص آزمايش هاي خاصي روي آن انجام شود. يکي از راه هاي تشخيص تست سوربيتول است که E.coli O157:H7 به علت عدم توانايي در تخمير سوربيتول، منفي است. از ديگر راه هاي تشخيص سروتايپينگ همراه با استفاده از تکنيک PCR است.
تغيرات آزمايشگاهي در هنگام بيماري اختصاصي نيست. به طوري که معمولا لکوسيت هاي سرم افزايش مي يابد ولي در اغلب بيماران لکوسيت هاي مدفوع کمتر از 10 ديد ميکروسکوپي قوي است.حتي در کساني که اسهال خوني دارند. در آنها علامت اثر انگشت (Thumb printing) بخصوص در کولون صعودي و عرضي که نشان دهنده، ادم و خونريزي زير مخاط است ديده مي شود. در اندسکوپي، مخاط کولون ادماتوهيپراميک و گاهي اولسراسيون هاي سطحي و يا بسودومامبران ديده مي شود (55).
تشخيص عفونت E.coli O157:H7 را بايد در هر بيماري که اسهال خوني دارد و يا کساني که با سندرم هموليتيک اورميک، تحت بررسي هستند در نظر داشت.
وقتي به اين عفونت مشکوک شوند. بايد نمونه مدفوع براي تست هاي اختصاصي تهيه شود.بر خلاف بقيه سوش هاي coli.E، سروتيپ 7H:157O ،سوربيتول در مدت 24 ساعت تخمير نمي کند و کلني هاي بدون رنگ حاوي سوربيتول در محيط کشت Mae Con key agar تشکيل مي دهد. آنتي ژن157O را همراه با تست آگلوتيناسيون براي نشان دادن آنتي سرم اختصاصي H به منظور تاييد تشخيص، با اهميت مي باشد.
در آزمايشگاه رفرانس نشان دادن توکسين و تعيين تايپ هم با بررسي روي سلول هاي ورو يا با هيبريداسيون با DNA probes اختصاصي يا PCR انجام مي شود(59).

13-1 اپيدميولوژي
اين بيماري تاکنون از 30 کشور دنيا در5 قاره جهان گزارش شده است.بروز سالانه آن در کشورهاي اسکاتلند، کاناداو آمريکا حود 8_9 در هر صد هزار نفر جمعيت است. در بعضي نقاط از جمله آمريکاي جنوبي بخصوص آرژانتين، سندرم هموليتيک اورميک اندميک بوده و 5-10 برابر آمريکاي شمالي است (54).
بيماري انسان در فصول گرم سال در نيمکره شمالي و جنوب شايع تر است، دفع ارگانيسم در حيوانات هم در فصل گرم نقش مهمي در انتقال بيماري دارد. گاوهاي سالم مهمترين



قیمت: تومان


پاسخ دهید